活/死细胞双染色试剂盒实验操作原理

原理

细胞介导的细胞毒性是一种重要现象，其特征是免疫系统使受损的细胞在体内被细胞溶解。区分活细胞和死细胞对于研究生长控制和细胞死亡非常重要。活/死细胞双重染色试剂盒提供了一种方便的测定方法，以评估细胞的活力，它基于使用两种探针同时测定活细胞和死细胞的方法，这些探针测量公认的细胞健康参数：质膜完整性和细胞内酯酶活性。该试剂盒利用可渗透细胞的绿色荧光染料Ca-AM（Ex/Em=488/530 nm）染色活细胞，并使用不可渗透细胞的红色荧光染料PI（Ex/Em=535/617 nm）用来染死细胞。   

自备耗材

·24孔板、可调节式移液枪及枪头

·离心机

·荧光显微镜或流式细胞仪

·去离子水、PBS

试剂准备

Ca-AM: 冰上避光保存。

PI: 冰上避光保存。

1×Assay Buffer：用去离子水把10×Assay Buffer稀释到1×Assay Buffer。使用前加热到37℃。

Staining Solution： 每 1 mL Assay Buffer 中加入 1 µL Ca-AM 和 1 µL PI，根据使用样本的数量按比例放大实验。

实验步骤

A. 流式细胞术定量

1. 用预期的方法处理细胞；

注意：对于所有的处理和未处理的细胞样本，建议把未染色的对照组细胞悬浮在1×Assay Buffer（不含有Ca-AM和PI），用于流式细胞分析；

2. 对于非贴壁细胞，收集1-5×10⁵个细胞离心 (4℃, 300 g, 5 min)，用预冷的PBS洗涤2次，弃去PBS。对于贴壁细胞，先用胰蛋白酶（不含 EDTA）消化细胞，然后离心；

3. 在 500 uL Staining Solution 中悬浮细胞；

4. 37℃避光孵育 15-30 min；

5. 用流式细胞仪分析。

B. 荧光显微镜检测

1. 对于悬浮细胞：按照步骤 A.1到步骤A.4进行流式细胞术，将步骤A.4的细胞悬浮液放在载玻片上。用玻璃盖玻片盖住细胞。尽快使用适当的滤光片通过荧光显微镜分析细胞。

2. 对于贴壁细胞，建议的方案如下：

（1）在六孔板的盖玻片上养细胞，在CO₂细胞培养箱中37℃培养至少24 h，再进行后续实验；

（2）用预期的方法处理细胞，在不含诱导剂条件下孵育细胞建立阴性对照组；

（3）用 PBS 洗涤细胞两次；

（4）把 0.5 mL 的 Staining solution 加入到细胞中，并在黑暗中于37℃条件下孵育 15-30 min；

（5）用 PBS 洗涤细胞两次；

（6）将盖玻片覆盖到载玻片上，尽快使用适当的滤光片通过荧光显微镜分析细胞。

注意：PI是一个潜在的诱变因子，使用本试剂时应采取适当的防护措施；Ca-AM 需要在干燥低温避光条件下储存，储存温度为-20℃。

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