乳酸脱氢酶（LDH）活性检测试剂盒实验解决方案
| 中文名称 | 货号 | 规格 |
| CheKine™ 乳酸脱氢酶（LDH）活性检测试剂盒（微量法）/CheKine™ Micro Lactate Dehydrogenase (LDH) Assay Kit | KTB1110 | 96T/480T |
自备耗材·酶标仪或可见分光光度计（能测450 nm处的吸光度）·恒温箱、制冰机、低温离心机·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头·去离子水·匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。1×Assay Buffer: 使用前，Assay Buffer (5×)用去离子水稀释5倍，浓度为1×Assay Buffer，平衡到室温；4℃保存。Lactate: 即用型；整个实验过程中，冰上避光放置；分装避光保存于-20℃。NAD: 即用型；整个实验过程中，冰上避光放置；分装避光保存于-20℃。WST-8: 即用型；整个实验过程中，冰上避光放置；分装避光保存于-20℃。Enhancer: 即用型；整个实验过程中，冰上避光放置；分装避光保存于-20℃。Working Reagent：每孔准备55 µL工作液，现配现用：吸取31 µL 1×Assay Buffer，8 µL NAD, 5 µL WST-8, 1 µL Enhancer和10 μL Lactate混合均匀。Lactate Dehydrogenase Standard (20 U/mL)：把20 µL Lactate Dehydrogenase Standard (1 KU/mL)用980 μL 1×Assay Buffer稀释至20 U/mL，混合均匀；冰上避光放置；不稀释的标准品分装保存于-20℃。标准曲线设置：按下表所示，用1×Assay Buffer将20 U/mL标准品稀释为20、16、12、8、4、2、1 U/mL的标准溶液。
序号 | 20 U/mL Standard体积（µL） | 1×Assay Buffer体积（µL） | 标准品浓度（U/mL） | ||||
Std.1 | 200 | 0 | 20 | ||||
Std.2 | 160 | 40 | 16 | ||||
Std.3 | 120 | 80 | 12 | ||||
Std.4 | 80 | 120 | 8 | ||||
Std.5 | 40 | 160 | 4 | ||||
Std.6 | 20 | 180 | 2 | ||||
Std.7 | 10 | 190 | 1 | ||||
注意：每次实验，请使用新配制的标准品；配制好的标准品需要在4 h之内使用。
样本制备注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。1.动植物组织：称取约0.1 g样本，加入1 mL预冷的1×Assay Buffer，冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心15 min，取上清液，置冰上待测。2.细胞（菌）：收集500万细胞（菌）到离心管内，用冷PBS清洗细胞（菌），离心后弃上清，加入1 mL 1×Assay Buffer，冰浴超声波破碎细胞（菌）5 min（功率20%或200 W，超声3 s，间隔7 s，重复30次），然后10,000 g，4℃离心15 min，取上清液，置冰上待测。3.血清、血浆等液体样本：直接测定。注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。实验步骤1.酶标仪或可见分光光度计预热30 min以上，调节波长到450 nm，可见分光光度计用去离子水调零。2.操作表（下述操作在96孔板或微量玻璃比色皿中操作）：
试剂 | 空白孔（μL） | 标准孔（μL） | 测定孔（μL） | ||||
样本 | 0 | 0 | 50 | ||||
Standards | 0 | 50 | 0 | ||||
去离子水 | 50 | 0 | 0 | ||||
Working Reagent | 50 | 50 | 50 | ||||
1. 混匀后，37℃避光孵育30 min，测定450 nm处吸光度，空白孔记为A空，标准孔记为A标，测定孔记为A测。计算ΔA测=A测-A空，ΔA标=A标-A空。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测小于0.001可适当加大样本量。如果ΔA测大于2.0，样本可用1×Assay Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。
结果计算
注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。
1. 标准曲线的绘制
以标准溶液浓度为y轴，ΔA标为x轴，绘制标准曲线。
2. LDH含量的计算
将样本的ΔA测代入方程得到y值（U/mL）。
(1) 按样本鲜重计算
LDH含量 (U/g 鲜重)=y×V样÷(W×V样÷V样总)×n=y÷W×n
(2) 按蛋白浓度计算
LDH含量 (U/mg 蛋白)=y×V样÷(V样×Cpr)×n=y÷Cpr×n
(3) 按样本体积计算
LDH含量 (U/mL)=y×V样÷V样×n=y×n
(4) 按细胞（菌）数量计算
LDH含量 (U/104 cells)=y×V样÷(500×V样÷V样总)×n=y÷500×n
V样：加入样本体积，0.05 mL；W：样本质量，g；V样总：加入1×Assay Buffer体积，1 mL；n：样本稀释倍数；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；500：细胞（菌）总数，500万。
结果展示
Figure 1. LDH的标准曲线。数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线
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