过氧化氢酶（CAT）活性分析试剂盒实验解决方案

中文名称	货号	规格
CheKine™ 过氧化氢酶 (CAT) 活性分析试剂盒（微量法）/CheKine™ Micro Catalase (CAT) Activity Assay Kit	KTB1040	96T/480T

原理过氧化氢酶（Catalase, CAT, EC 1.11.1.6）是一种常见的抗氧化酶，可催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧，普遍存在于含有细胞色素系统的好氧细胞中。过氧化氢对细胞是高度有害的，其积累将导致细胞靶标（例如DNA，蛋白质和脂质）的氧化，从而导致诱变和细胞死亡。通过使用过氧化氢酶从细胞中去除过氧化氢（H2O2），可以防止细胞的氧化损伤。过氧化氢酶在氧化应激相关疾病中的作用已被广泛研究。过氧化氢酶还表现出过氧化活性，其中低分子量醇可用作电子供体。脂肪醇是过氧化氢酶的特异性底物，然而，具有过氧化活性的其它酶不利用这些底物。CheKine™ 过氧化氢酶 (CAT) 活性分析试剂盒（微量法），提供了一种简单易用的微量法，用于分析不同生物样品（血清、血浆、细胞/组织裂解液、生物液体）中过氧化氢酶活性。该检测试剂盒利用过氧化氢酶的过氧化物酶功能来测定过氧化氢酶的活性。在合适浓度的H2O2存在的条件下，过氧化氢酶与甲醇反应，产生甲醛，生成的甲醛可以与显色物反应，产物可以在540 nm处测量吸光度，样本中的过氧化氢酶活性与OD值成正比。
自备耗材·酶标仪或可见光分光光度计（能测540 nm处的吸光度）·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头·水浴锅，离心机·去离子水·匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备1×Assay Buffer: Assay Buffer (10×)用去离子水稀释至1×Assay Buffer。取2 mL Assay Buffer (10×)加入18 mL去离子水稀释至1×Assay Buffer，可在4℃保存至少两个月。1×Sample Diluent: Sample Diluent (10×)用去离子水稀释至1×Sample Diluent。取5 mL Sample Diluent (10×)加入45 mL去离子水稀释至1×Sample Diluent，可用来稀释Formaldehyde Standards，Catalase (Control)和样本，可在4℃保存至少两个月。1×Lysis Buffer: Lysis buffer (10×)用去离子水稀释至1×Lysis Buffer。取5 mL Lysis buffer (10×)加入45 mL去离子水稀释至1×Lysis Buffer，可在4℃保存至少两个月。Methanol: 即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。Formaldehyde Standard: 即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。注意：Formaldehyde Standard有毒性，实验时请佩戴口罩手套等防护措施。Diluted Catalase (Control): 该瓶含有牛肝脏CAT粉末，作为阳性对照。用0.5 mL 1×Sample Diluent复溶并混合（复溶的酶可在-20℃保存一个月）。取10 µL已经复溶的酶，用4.99 mL 1×Sample Diluent工作液稀释（稀释的酶可4℃保存30 min）。Potassium Hydroxide: 即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。Diluted Hydrogen Peroxide: 用9.96 mL去离子水稀释40 µL Hydrogen Peroxide。Diluted Hydrogen Peroxide可于冰上保存2 h。Chromogen: 即用型；使用前，平衡到室温；-20℃避光保存。Potassium Periodate: 即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。注意：Potassium Periodate具有强氧化性，与可燃物料接触可能引起火灾。标准品制备：用9.99 mL 1×Sample Diluent稀释10 µL Formaldehyde Standard，得到4.25 mM的储存液。按下表所示，进一步稀释标准品。

Standard	Formaldehyde (µL)	1×Sample Diluent (µL)	Final Concentration (µMFormaldehyde)
1	4	996	2
2	10	990	5
3	30	970	15
4	60	940	30
5	90	910	45
6	120	880	60
7	150	850	75

注意：Final formaldehyde concentration 是指在170 µL反应体系里的终浓度。

样本制备1．动植物组织：称取0.1 g组织加入1 mL预冷的1×Lysis buffer将样本进行匀浆。匀浆后的样本，10,000 g，4℃离心15 min，取上清液做进一步分析。2．细胞：收集5×106个细胞加入1 mL预冷的1×Lysis buffer，冰上匀浆，10,000 g，4℃离心15 min，取上清液做进一步分析。3．血清、血浆：按常规方法收集血清，1×Sample Diluent稀释后即可作为血清样本进行检测；用抗凝管收集血液，颠倒混匀。600 g，4℃离心10 min，移取上清至另一新的离心管中，适量1×Sample Diluent稀释后即可作为血浆样本进行检测。注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。处理好的样本须当天检测。测定过程中样本在冰上放置，以免变性和失活。如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤1.酶标仪或可见光分光光度计预热30 min以上，调节波长至540 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。2.在96孔板或微量玻璃比色皿中按照如下方式加样：

试剂		空白孔（μL）		标准孔（μL）		测定孔（μL）		阳性对照孔（μL）
1×Assay Buffer	100		100		100		100
Methanol	30		30		30		30
1×Sample Diluent	20		0		0		0
Stds	0		20		0		0
Sample	0		0		20		0
Diluted Catalase (Control)	0		0		0		20
Diluted Hydrogen Peroxide	20		20		20		20
充分混匀，室温孵育20 min
Potassium Hydroxide	30		30		30		30
Chromogen	30		30		30		30
充分混匀，室温孵育10 min
Potassium Periodate	10		10		10		10

3.充分混匀，室温孵育5 min，立即测定540 nm处的吸光值A。计算ΔA测=A测定-A空白，ΔA标=A标准-A空白。注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.001可适当加大样本量。如果ΔA大于0.8，样本可用1×Sample Diluent进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。
结果计算1.标准曲线绘制：以标准溶液Final formaldehyde concentration (µM)为y轴，ΔA标为x轴，绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。2.根据标曲计算样本产生的甲醛浓度 Formaldehyde (µM)=y×(0.17 mL÷0.02 mL)=8.5×y3.再计算CAT的酶活，1个酶活单位定义为：25℃环境下，每分钟产生1.0 nmol甲醛的酶的量 (1)按样本蛋白浓度计算CAT Activity=μM of Sample÷(20 min)÷Cpr×Sample dilution=0.425×y÷Cpr×Sample dilution (nmol/min/mg prot)(2)按液体体积计算CAT Activity=μM of Sample÷(20 min)×Sample dilution=0.425×y×Sample dilution (nmol/min/mL)(3)按样本鲜重计算CAT Activity=μM of Sample÷(20 min)÷W×Sample dilution=0.425×y÷W×Sample dilution (nmol/min/g)(4)细胞数量计算CAT Activity=μM of Sample÷(20 min)÷cells number×Sample dilution=0.425×y÷500×Sample dilution (nmol/min/104 cells)W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；500：细胞总数，500万。

Figure 1. 过氧化氢酶的标准曲线

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