类器官培养秘籍-胃类器官的培养

近年来，类器官培养热潮一直不断攀升，而胃类器官也受到大多数人的关注，胃类器官是一种衍生于胃干细胞或者多能诱导干细胞的类器官模型，体外培养的胃类器官含有多种细胞克隆亚群，其培养环境模拟活体内的真实微环境，因此胃类器官在细胞成分、组织构架及特定功能等方面与胃上皮组织高度相似，可实现在体外培养环境中对胃上皮组织的复制，为人类胃生理与疾病的研究提供了一个新的平台。

胃上皮类器官培养的原理就是3D环境下培养胃上皮干细胞，加入生长因子和小分子刺激干细胞自发分裂、分化形成球囊状结构。胃上皮腺体可分为胃底/体腺和胃窦/幽门腺两部分，胃底腺和胃窦腺均可构建胃上皮类器官，其中含有的细胞成分与各自上皮一致。

胃类器官的培养较为繁琐，特别是获取原始干细胞操作步骤较多，操作时间长，培养过程中也有些注意事项，对于初学者若不注意一些操作细节，很可能导致培养失败。所以亚科因技术部实践总结了以下全面的操作流程，并强调在培养操作中的注意要点，以便您可以清楚透彻的get其培养方法，帮助大家提高培养的成功率。

胃类器官的制备方法

（1）小鼠腹腔麻醉后以颈椎脱臼法处死，剖腹，分离胃移至置于冰上的培养皿中。

（2）沿胃大弯侧剪开胃壁，冰PBS冲洗并分离胃体部。去除胃肌层，将剩下的上皮层剪成直径小于2mm大小的碎片。用10 ml的移液管将组织碎片的移至15ml离心管中，添加10ml冰PBS反复吹打重悬，然后让组织碎片自然沉降于管底，弃去约7.5ml的上清。

（3）重复该重悬清洗步骤5～10次至上清液清亮，弃上清。

（4）最后一次漂洗后，吸除大部分上清液，向沉淀中加入含10mM EDTA溶液(25ml)室温消化60min后，弃上清。

（5）加入10ml冰PBS用移液管轻轻吹打几次，等待组织块沉淀下去，弃去上清，将组织块转移到10cm²的培养皿中，在组织块上覆盖一个无菌的载玻片，戴上无菌手套，用两手的大拇指按压载玻片，将组织块腺体中的细胞挤压出来。

（6）加入PBS反复吹打培养皿和载玻片上的组织块，吹打后等待组织块自然沉降，小心吸取上清液并使用70μm滤网过滤，将滤液收集于干净的50 ml管中。

（7）如果收集的细胞不够多，可以重复5)和6)步骤，将几份混合液以200×g离心5min。小心地倒出并丢弃上清液。

配制类器官培养基：在基础培养基(DMEM/F12)中加入:

（8）将沉淀重悬于含有冰的类器官培养基中，吸取10μL置于玻璃载玻片或血细胞计数器上。使用倒置显微镜，计数分离的细胞数目，200g离心5min，小心吸出并弃去上清。用类器官培养基重悬细胞至1.6×10⁵个/ml。

（9）将离心管置于冰上，吸取150 μL重悬好的细胞悬液，加入等体积的预冷的Matrigel，小心地上下吹打十次以充分混匀，注意避免产生气泡。

（10）吸取50μL悬液，加入到提前预热的24孔板每个孔中的中心部位，样品应在每个孔的中心形成圆顶结构。为了防止接种时出现气泡，枪头内液体不要全部打出。分别接种24孔板4个孔。

（11）将培养板在37℃下静置10分钟以待基质胶完全凝固。将平板转放入培养箱时，应注意不要破坏凝固后的液滴。

（12）使用移液枪沿着孔侧壁向每个孔中轻轻地加入500μL室温(15-25℃)的配置的类器官培养基。不要将培养基从圆顶结构上直接加入。

（13）向其它未接种的孔中加入无菌PBS以保证培养时的湿度。

（14）将培养板的盖子盖好，并在37℃和5%CO₂下进行培养。

（15）每隔2天进行完全换液。换液时将移液枪头放在孔底边缘小心地将原有液体培养基吸出，并加入为500μL新鲜的室温类器官培养基。

（16）在培养第7至10天以1:3~1:6的比例进行类器官传代，以避免在类器官过度生长和空腔内积累过量的碎屑。

小鼠胃类器官的传代

（1）胃解剖上可分为胃底、胃体、胃窦、幽门（小鼠胃还拥有前胃部分），对应的胃上皮可以分为胃底/体腺和胃窦/幽门腺两部分，两者在细胞构成上差别较大。它们均含有表面黏液细胞、颈粘液细胞、干细胞、内分泌细胞；但胃底腺含有壁细胞（分泌盐酸）和主细胞（分泌胃蛋白酶），而胃窦腺不含有这两种细胞组分。胃底腺和胃窦腺均可以构建成胃上皮类器官。胃腺体内的干细胞能够分裂、分化，自发形成球囊状结构；囊壁上含有所有腺体内的细胞成分。囊内为上皮的腔面，内含脱落细胞、分泌物等；囊外为上皮的基底面，为细胞外基质成分。

（2）EDTA消化液需要用无钙无镁的PBS溶液进行稀释，否则影响EDTA的螯合作用。

胃上皮及其类器官的组织细胞结构

类器官的发生、发展、成熟与干细胞的发育以及分化息息相关。特定类器官的获得，需要干细胞发育过程中各种复杂信号通路的调节，这个过程往往通过类器官培养基中的活性成分—细胞因子和小分子来实现。其中细胞因子是类器官培养基的关键组分之一。培养基中添加细胞因子有利于细胞分化和增殖，促进类器官的形成。

胃类器官培养需要用到的细胞因子

亚科因生物自主研发生产并经过类器官培养验证的低内毒素Noggin、EGF、BMP-4和Shh等细胞因子，每微克蛋白里内毒素含量<1.0EU，纯度>95%，每支细胞因子配备1mL配套复溶Buffer，复溶后产品性能稳定，冻干粉形式包装，安全放心。外包装采用无热源无内毒素EP管，从包装上杜绝内毒素干扰。为类器官培养设计，具有高活性、高纯度、高批间一致性，已获得市场认可，让您买得放心，使用更安心！

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