GST标签蛋白免疫沉淀试剂盒(磁珠法)-IPKine™

自备耗材

• 磁分离架
• 垂直旋转混合仪
• 低温离心机
• 可调节式移液枪及枪头
• 去离子水
• PBS缓冲液
• 匀浆器（组织样本）

试剂准备

Non-Denaturing Lysis Buffer：天然蛋白裂解液，用于 IP 样本的提取，即用型；置于冰上待用；4℃保存。

1×TBS：临用前配制，向 10×TBS 中添加去离子水，将 10×TBS 稀释成 1×TBS；4℃保存。

Anti-GST Magnetic Beads：即用型；4℃保存，避免冷冻。

Mouse IgG Magnetic Beads：即用型；4℃保存，避免冷冻。

Elution Buffer：即用型；用于非变性的酸洗脱，4℃保存。

Neutralization Buffer：即用型；用于中和酸洗脱的非变性蛋白，4℃保存。

SDS-PAGE Loading Buffer (5×)：即用型，-20℃保存。

实验步骤

A. 蛋白样品的准备

注意：取一定量的制备好的样本作为全细胞裂解液（WCL）用于后续的 Western Blotting 检测。

1. 细胞蛋白提取：

1. 细胞收集（贴壁细胞：10 cm 细胞培养皿中单层细胞长满 80%-90%，吸除细胞培养液，PBS 洗涤 1 次；悬浮细胞：离心收集 5×10⁶ 细胞，PBS 洗涤 1 次）。
2. 0.5-1 mL Non-Denaturing Lysis Buffer 加预冷的 PBS 到细胞中，4℃ 裂解细胞 5 min，期间用移液枪反复吹打，然后将细胞悬浮液转移到新的离心管中。
3. 12,000 rpm，4℃，离心 10 min，收集上清。

2. 组织蛋白提取：

1. 称取 0.1 g 组织，加入 1 mL Non-Denaturing Lysis Buffer，匀浆器研磨。（若需要提高蛋白浓度，可以适量减少 Non-Denaturing Lysis Buffer 用量）。
2. 将匀浆液转移至新的离心管中，冰上裂解 5 min。
3. 12,000 rpm，4℃，离心 10 min，收集上清。

3. 细菌蛋白提取：

1. 12,000 rpm，4℃，离心 2 min 收集细菌，PBS 洗涤 1 次。
2. 每 100-200 μL 菌液加 1 mL Non-Denaturing Lysis Buffer 重悬细菌，冰浴超声波破碎细菌 5 min（功率 200 W，超声 3 s 间隔，7 s 重复 30 次）。
3. 12,000 rpm，4℃，离心 10 min，收集上清。

B. 磁珠准备

注意：按照每 500 μL 蛋白样品取 20 μL Anti-GST Magnetic Beads 的比例吸取磁珠混悬液。以下实验步骤按照加入 20 μL Anti-GST Magnetic Beads 的量，进行具体操作说明。

1. 将磁珠加入 1.5 mL 离心管中，离心管置于磁分离架上，静置 10 s，吸弃上清。
2. 加入 1 mL 1×TBS，重悬磁珠，离心管置于磁分离架上，静置 10 s，吸弃上清，重复 3 次，用 1×TBS 重悬磁珠。

C. 免疫沉淀

1. 处理好的 Anti-GST Magnetic Beads 加入 500 μL 蛋白样品，置于垂直旋转混合仪室温下孵育 1-2 h 或 4℃过夜。

2. 离心管置于磁分离架上，静置 10 s，去除上清。上清液可转移至新的离心管中，用于检测免疫沉淀的效果。
3. 加入 1 mL 1×TBS，重悬磁珠，离心管置于磁分离架上，静置 10 s，吸弃上清，重复 3-5 次，直至上清液 OD₂₈₀ 小于 0.05。
4. 洗脱

a）变性洗脱法：

此方法洗脱的样品适用于 SDS-PAGE 和 Western Blotting 检测。向离心管中加入 100 μL（5 倍磁珠体积）1×SDS-PAGE Loading Buffer（用 1×TBS 将 5×SDS-PAGE Loading Buffer 稀释 5 倍）混匀，95℃ 加热 5 min，然后进行离心，800 rpm 离心 1 min，收集上清液，进行 SDS-PAGE 和 Western Blotting 检测分析。

b）酸洗脱法：

此方法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。向离心管中加入 100 μL（5 倍磁珠体积）Elution Buffer 混匀，然后在室温下置于垂直旋转混合仪孵育 5-10 min，800 rpm 离心 2 min，吸取上清液，收集洗脱组分，即为 GST 标签蛋白及其复合物，收集上清液至新的离心管中，并立即加入 10 μL Neutralization Buffer，将洗脱组分调节至 pH 7.0-8.0。为了获得最大的洗脱效率，可重复用酸洗脱，并将相同样品合并，GST 标签蛋白及其复合物置于 4℃ 待用，-20℃或-80℃长期保存。可向磁珠沉淀中加入 100 μL 1×SDS-PAGE Loading Buffer，用于检测免疫沉淀及洗脱效果。

结果展示

图 1 GST 标签蛋白免疫沉淀试剂盒（磁珠法）用于 GST-Tag 融合蛋白的免疫沉淀效果图，图中数据仅供参考。HEK293T 细胞转染 GST-Tag 质粒 48 h 后，Non-Denaturing Lysis Buffer 裂解细胞，免疫沉淀检测，Western Blotting GST 一抗选用标签小鼠单克隆抗体（2A8）（货号：ABT2030），稀释比例 1:5000；二抗选用山羊抗小鼠 IgG 轻链二抗，HRP 标记（消除重链干扰）（货号：A25012），稀释比例 1:2000；使用超敏型 ECL 发光液（飞克级）（货号：BMU102）显影。Lane 1 为全细胞裂解液（WCL）；Lane 2 为 Mouse IgG Magnetic Beads 免疫沉淀后经变性洗脱后的样品；Lane 3 为 Anti-GST Magnetic Beads 免疫沉淀后经变性洗脱后的样品；Lane 4 为 Anti-GST Magnetic Beads 免疫沉淀后经酸洗脱后的样品。酸洗脱仅含有 GST-Tag 融合蛋白，不包含抗体重链和轻链。

常见问题