小鼠白介素-2 ELISA定量试剂盒-EliKine™

自备耗材

• 酶标仪（能测450 nm处的吸光度）
• 多通道移液器或自动洗板机
• 恒温箱、低温离心机
• 可调节式移液枪及枪头
• 去离子水

试剂准备

Standard Diluent：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。Standard Diluent用于稀释标准品。

Sample Diluent：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。Sample Diluent用于稀释样品。

Mouse IL-2 Standard: 即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

HRP-conjugated Mouse IL-2 Detect Antibody：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

HRP Substrate A：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

HRP Substrate B：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

Stop Solution：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

1×Wash Buffer:Wash Buffer使用前平衡到室温，48 T用去离子水将Wash Buffer稀释20倍，96 T用去离子水将Wash Buffer稀释30倍得到1×Wash buffer。轻轻混合以避免起泡，室温保存，此溶液可稳定保存30天。

标准曲线设置

按下表所示，用Standard Diluent将3,600 pg/mL标准品稀释为2,400、1,600、800、400和200 pg/mL的Mouse IL-2标准品。

注意：每次实验都需要新配制标准品。

样本制备

1. 细胞培养上清：离心除去颗粒，立即测定或分装-20℃保存，避免反复冻融。
2. 血清：使用血清分离管，让样品在室温下凝结30 min，然后1,000 g离心15 min。取上层血清立即测定或分装-20℃保存，避免反复冻融。
3. 血浆：使用EDTA、肝素或柠檬酸盐作为抗凝剂收集血浆。在收集后30 min内1,000 g离心15 min。立即测定或分装-20℃保存，避免反复冻融。
4. 组织：称取0.1 g组织，加入0.9 mL冰预冷的0.01 M pH7.4的PBS（可加入蛋白酶抑制剂）冰浴匀浆，收集匀浆液4℃，10,000 g离心10 min，取上清立即测定或分装-20℃保存，避免反复冻融。
5. 细胞：贴壁细胞用冷的PBS轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1,000 g离心5min后收集细胞；悬浮细胞可直接离心收集。收集的细胞用冷的PBS洗涤3次。每10^6个细胞中加入150-200 μL PBS重悬（推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂；若含量很低可减少PBS的体积）并通过冰浴超声破碎2 min（功率20%或200 W，超声3 s，间隔7 s，重复12次）。将提取液于4℃，10,000 g离心10min，取上清立即测定或者分装-20℃保存，避免反复冻融。
6. 尿液、唾液等其他液体生物样本：3,000 g离心10min，取上清立即测定或者分装-20℃保存，避免反复冻融。

注意：不要使用严重溶血或脂血的标本。如果样品要在24 h内使用，则可以将其储存在2至8℃，避免反复冻融。测定前，应将冷冻样品缓慢升至室温并轻轻混合。

实验步骤

1. 从板框上取下多余的板条，将它们放回装有干燥剂包的铝箔袋中，然后重新密封。
2. 分别设空白孔（空白对照孔不加样品、HRP-conjugated Mouse IL-2 Detect Antibody，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加入40 μL Sample Diluent和10 μL样品（样品最终稀释倍数为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。标准孔依次加入50 μL不同浓度的标准品。给酶标板覆膜，在37℃下孵育30 min。
3. 除去每孔中的液体并洗涤，重复该过程总共洗涤三次。使用多通道移液器或自动清洗机每孔加入250 μL 1×Wash buffer进行洗涤，然后静置1-2 min。在每个步骤中完全去除液体对于获得良好性能至关重要。最后一次洗涤后，倒置酶标板并用干净的纸巾吸干以除去任何剩余的1×Wash Buffer。
4. 每孔加入50 μL的HRP-conjugated Mouse IL-2 Detect Antibody，空白孔除外。给酶标板覆膜，在37℃下孵育30 min。
5. 重复步骤3中的洗涤。
6. 每孔先加入50 μL HRP Substrate A，再加入50 μL HRP Substrate B，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15 min。
7. 每孔加入50 μL Stop Solution，Stop Solution应按照与TMB相同的顺序加到板中。孔中的颜色应从蓝色变为黄色。如果孔中的颜色为绿色或颜色变化不均匀，请轻轻敲击板以确保彻底混合。
8. 在15 min内，以空白孔调零，测定每孔450 nm处的吸光值。

结果计算

1. 计算每个标准品和样品的复孔平均OD值。
2. 标准曲线的绘制：以标准品浓度为x轴，各标准品的平均吸光度为y轴，绘制标准曲线。可以使用作图软件来创建标准曲线。

注意：如果样品被稀释，从标准曲线读取的浓度必须乘以稀释系数。