通用型免疫(共)沉淀(IP/Co-IP)工具箱(琼脂糖)

自备耗材

• 垂直旋转混合仪
• 低温离心机
• 可调节式移液枪及枪头
• 去离子水
• PBS缓冲液
• 匀浆器（组织样本）
• SDS-PAGE Loading Buffer

试剂准备

Non-Denaturing Lysis Buffer：天然蛋白裂解液，用于IP样本的提取，即用型；置于冰上待用；4℃保存。

Denaturing Lysis Buffer：变性蛋白裂解液，可用于直接WB检测样本的提取，即用型；置于冰上待用；4℃保存。

1×Wash Buffer：临用前配制，向10×Wash Buffer中添加去离子水，将10×母液稀释成1×工作液；4℃保存。

注意：10×Wash Buffer 4℃保存会产生沉淀，使用前可在37℃水浴中预热10 min溶解沉淀。

Protein A/G Agarose：即用型；4℃保存，避免冷冻。

Elution Buffer：即用型；用于非变性蛋白洗脱，4℃保存。

Neutralization Buffer：即用型；用于中和洗脱的非变性蛋白，4℃保存。

100×Proteinase Inhibitor Cocktail：临用前Lysis Buffer中加入终浓度1×Proteinase Inhibitor Cocktail；-20℃保存。

Mouse IgG：即用型；用于小鼠来源IP抗体的阴性对照，-20℃保存。

Rabbit IgG：即用型；用于兔来源IP抗体的阴性对照，-20℃保存。

IPKine™ HRP, Goat Anti-Mouse IgG LCS：HRP标记的山羊抗小鼠IgG轻链二抗，建议WB稀释比例1:1,000-1:10,000（推荐1:2,000）；-20℃保存。

IPKine™ HRP, Mouse Anti-Rabbit IgG LCS：HRP标记的小鼠抗兔IgG轻链二抗，建议WB稀释比例1:1,000-1:10,000（推荐1:2,000）；-20℃保存。

实验步骤

一、免疫沉淀

A. 蛋白样品的准备

1. 细胞蛋白提取：
   1. (1) 细胞收集（贴壁细胞：10 cm细胞培养皿中单层细胞长满80%-90%，吸除细胞培养液，PBS洗涤1次；悬浮细胞：离心收集5×10⁶细胞，PBS洗涤1次）。
   2. (2) 加入0.5-1 mL预冷的Non-Denaturing Lysis Buffer（Non-Denaturing Lysis Buffer中加入终浓度1×Proteinase Inhibitor Cocktail），4℃裂解细胞5 min，期间用移液枪反复吹打，然后将细胞悬浮液转移到新的离心管中。
   3. (3) 12,000 rpm，4℃，离心10 min，收集上清，然后采用BCA法测定蛋白浓度（推荐使用Abbkine货号：KTD3001蛋白质定量试剂盒（BCA法））。
2. 组织蛋白提取：
   1. (1) 植物或动物组织样品：称取0.1 g组织，加入1 mL Non-Denaturing Lysis Buffer（Non-Denaturing Lysis Buffer中加入终浓度1×Proteinase Inhibitor Cocktail），液氮或匀浆器研磨。（若需要提高蛋白浓度，可以适量减少Non-Denaturing Lysis Buffer用量）。
   2. (2) 将匀浆液转移至新的离心管中，冰上裂解5 min。
   3. (3) 12,000 rpm，4℃，离心10 min，收集上清，然后采用BCA法测定蛋白浓度（推荐使用Abbkine货号：KTD3001蛋白质定量试剂盒（BCA法））。

注意：总蛋白浓度选择在0.5-1 μg/μL范围内较为合适。通常针对目标蛋白的表达量不同，需要对总蛋白浓度进行预实验调整。免疫共沉淀（Co-IP）通常必须使用未经冻存的新鲜蛋白样品。普通的免疫沉淀虽然可以使用冻存的蛋白样品，但也宜用新鲜的蛋白样品为佳。

B. 去除非特异性结合（可选做）：

1. (1) 取40 μL Protein A/G Agarose（混悬液）加入到1.5 mL离心管中，800 rpm，4℃，离心2 min，吸弃上清。

注意：Protein A/G Agarose使用前一定要充分颠倒若干次使其混合均匀。若因保护液减少导致的结块，可补充保护液（20%乙醇的0.1 M pH 7.4 PBS溶液），使之与琼脂糖的体积保持一致。Protein A/G Agarose含有0.5 mL琼脂糖和0.5 mL保护液，实际每个样品需吸取40 μL混悬液。

2. (2) 加入1 mL 1×Wash Buffer，重悬Protein A/G Agarose，800 rpm，4℃，离心2 min，吸弃上清，重复3次。
3. (3) 加入0.2-1 mg（0.2-1 mL）蛋白样品，4℃摇转孵育30 min。（推荐用垂直旋转混合仪，低速旋转）
4. (4) 800 rpm，4℃，离心2 min，取上清用于后续的免疫沉淀。

注意：离心时，离心力不宜过高，会损坏Protein A/G Agarose，离心力在800-2,000 rpm即可。

C. 免疫沉淀

1. (1) 取40 μL Protein A/G Agarose（混悬液）加入到1.5 mL离心管中，800 rpm，4℃，离心2 min，吸弃上清。
2. (2) 加入1 mL 1×Wash Buffer，重悬Protein A/G Agarose，800 rpm，4℃，离心2 min，吸弃上清，重复3次。
3. (3) 加入0.2-2 μg抗体溶液，重悬Protein A/G Agarose，室温下置于垂直旋转混合仪孵育30 min，800 rpm离心2 min，收集上清液，沉淀用于后续Step (4)。

可选做，阴性对照：加入0.2-2 μL Mouse IgG或Rabbit IgG，重悬Protein A/G Agarose，室温下置于垂直旋转混合仪孵育30 min，800 rpm离心2 min，收集上清液，沉淀用于后续Step (4)。此步可排除IgG本身和目的蛋白或其它特定生物分子的非特异性结合。

注意：Protein A/G Agarose置于垂直旋转混合仪混匀时，要保证有一定的流动性，若不流动，加入一定量的1×Wash Buffer。

4. (4) 加入1 mL 1×Wash Buffer，重悬Protein A/G Agarose，800 rpm，4℃，离心2 min，吸弃上清，重复3次。
5. (5) 加入0.2-1 mg（0.2-1 mL）蛋白样品或上清（去除非特异性结合蛋白的上清），在室温下置于垂直旋转混合仪孵育1 h或4℃过夜。
6. (6) 800 rpm，4℃，离心2 min，收集上清液，沉淀用于后续Step (7)。
7. (7) 加入1 mL 1×Wash Buffer，重悬Protein A/G Agarose，800 rpm，4℃，离心2 min，吸弃上清，重复3次。
8. (8) 洗脱
   • a）变性洗脱法：此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE和Western Blotting检测。向离心管中加入20-50 μL 1×SDS-PAGE Loading Buffer混合均匀，100℃加热5 min，然后进行800 rpm离心1 min，收集上清液，进行SDS-PAGE和Western Blotting检测分析。
   • b）非变性洗脱法：此方法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。向离心管中加入20-50 μL Elution Buffer混匀，然后在室温下孵育10 min，800 rpm，4℃，离心2 min，吸取上清液，收集洗脱组分，即为目标抗原，收集上清液至新的离心管中，并立即加入1/10体积的Neutralization Buffer，将洗脱组分调节至pH 7.0-8.0，用于后续功能分析。

二、免疫共沉淀：

参考免疫沉淀的方法进行。