Pro 葡萄糖含量检测试剂盒(荧光法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 荧光酶标仪(激发波长 535 nm，发射波长 590 nm)
• 96孔全黑板、可调节式移液枪及枪头
• 恒温箱、制冰机、低温离心机
• 去离子水
• 匀浆器或研钵（如果是组织样本）

试剂准备

Assay Buffer：即用型；使用前，平衡到室温。-20℃保存。

Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温。-20℃避光保存。用不完的试剂-20℃避光分装保存 6个月，避免反复冻融。

注意：Reagent I 有毒，建议在通风橱进行实验。

Reagent II：即用型；-20℃避光保存。

Reagent III：即用型；-20℃避光保存。

Working Reagent：每孔准备 50 µL工作液，现配现用。按照 Assay Buffer：Reagent I：Reagent II：Reagent III=4,840 μL：50 μL：10 μL：100 μL的比例，混合均匀。

Standard (400 nmol/mL)：即用型；使用前，平衡到室温。-20℃避光保存。用不完的试剂-20℃避光分装保存 6个月，避免反复冻融。

标准品制备

4 nmol/mL 标准品：10 µL Standard用 990 µL Assay Buffer稀释；使用 4 nmol/mL标准品，按照下表所示，进一步稀释成标准品：

注意：每次实验，请使用新配制的标准品；配制好的标准品需要在 4 h之内使用。

样本制备

注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h内完成样品解冻。

1. 组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mLAssay Buffer，用匀浆器或研钵冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。

2. 细胞：收集 500万细胞到离心管内，用冷 PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入 1 mL Assay Buffer，冰浴超声波破碎细胞 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），然后 10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。

3. 血清（浆）等液体样本：10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。

在进行检测前，请依据下表对样本进行稀释，稀释液为 Assay Buffer（仅供参考）：

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 荧光酶标仪预热 30 min以上，调节激发波长到 535 nm，发射波长到 590 nm。

2. 操作表（下述操作在 96孔全黑板中操作）：

充分混匀，37℃反应 15 min，记录各孔的荧光值 RFU，荧光激发波长 535 nm，荧光发射波长 590 nm，空白孔记为 RFU 空白，标准孔记为 RFU 标准，测定孔记为 RFU 测定。计算ΔRFU 测定=RFU 测定-RFU 空白，ΔRFU 标准=RFU 标准-RFU 空白。

注意：空白管和标准管只需做 1-2次。实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本稀释成不同浓度做预实验。根据预实验的结果，结合本试剂盒的线性范围：0.1-50 μM，选择合适的稀释倍数对样本进行检测。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

1. 标准曲线的绘制

以标准溶液浓度为 x轴，ΔRFU 标准为 y轴，绘制标准曲线，得到标准方程，将ΔRFU 测定带入方程得到 x (nmol/mL)。

2. 葡萄糖含量的计算：

（1）按样本蛋白浓度计算

葡萄糖(nmol/mg prot)=x÷Cpr×F

（2）按样本鲜重计算：

葡萄糖(nmol/g 鲜重)=x÷(W÷V 样总)×F=x÷W×F

（3）按照细胞数量计算

葡萄糖(nmol/104 cell)=x÷(n÷V 样总)×F=x÷n×F

（4）按样本体积计算：

葡萄糖(nmol/mL)=x×F

V 样总：加入 Assay Buffer体积，1 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；n：细胞数量，以万计；F：样本稀释倍数。

注意事项

1. ReagentⅠ具有光敏性，使用和保存需严格避光。
2. 如果Working Reagent 出现红色，可先对 Standard进行检测，若 Blank孔荧光值大于 Std.7 (0.78125 nmol/mL)，则 Working Reagent失效，反之可以继续使用。
3. 每次检测都需要建立新的标准曲线。
4. 如果 RFU 测定较低或ΔRFU 测定为负值，可适当减少样本稀释倍数或延长反应时间，但不得超过 30 min。
5. 如果样本测不出值，建议取新鲜样本，重新检测。