脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见光分光光度计（能测 265 nm处的吸光度）
• 96孔 UV板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管
• 水浴锅、低温离心机
• 去离子水
• 匀浆器或研钵（如果是组织样本）

试剂准备

Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

Reagent II：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

Reagent III：临用前配制；48 T加入 1.25 mL去离子水，96 T加入 2.5 mL去离子水，充分溶解，用不完的试剂 4℃避光保存 3天。

Reagent IV：临用前配制；48 T加入 1.25 mL去离子水，96 T加入 2.5 mL去离子水，充分溶解，用不完的试剂 4℃避光保存 3天。

样本制备

注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h内完成样品解冻。

1. 植物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL ReagentⅠ，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 细胞或细菌：收集 500万细胞或细菌到离心管内，用冷 PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入 1 mL ReagentⅠ，冰浴超声波破碎细胞或细菌 5 min（功率 30%或 300 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），然后 8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 血清（浆）：直接检测。

如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3002的蛋白质定量试剂盒（Bradford法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 265 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。
2. 将 Reagent II 置于 25℃水浴预热 30 min。
3. 操作表（下述操作在 96孔 UV板或微量玻璃比色皿中依次进行）：

迅速混匀后，记录 265 nm处 20 s时吸光值 A1和 140 s时的吸光值 A2，计算ΔA=A2-A1。

实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于 0.02可适当加大样本量。如果ΔA大于 0.8，样本可用 ReagentⅠ进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

A. 使用 96孔 UV板测定的计算公式如下

DHAR活性的计算

（1）按样本蛋白浓度计算：

酶活单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟还原生成 1 nmol AsA为 1个酶活单位。

DHAR(U/mg prot)=ΔA÷ε÷d×V 反总×10⁹÷(Cpr×V 样)÷T=184×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

酶活单位定义：25℃中每克样本每分钟还原生成 1 nmol AsA为 1个酶活单位。

DHAR(U/g 鲜重)=ΔA÷ε÷d×V 反总×10⁹÷(w×V 样÷V 样总)÷T=184×ΔA÷w

（3）按细菌或细胞数量计算：

酶活单位定义：25℃中每 10⁴细菌或细胞每分钟还原生成 1 nmol AsA为 1个酶活单位。

DHAR(U/10⁴)=ΔA÷ε÷d×V 反总×10⁹÷(n×V 样÷V 样总)÷T=184×ΔA÷n

（4）按液体体积计算：

酶活单位定义：25℃中每毫升液体每分钟还原生成 1 nmol AsA为 1个酶活单位。

DHAR(U/mL)=ΔA÷ε÷d×V 反总×10⁹÷V 样÷T=184×ΔA

ε：AsA在 265 nm处摩尔吸光系数，5.42×10⁴ L/mol /cm；10⁶：换算系数，1 mol=10⁶ μmol；d：96孔板光径，0.5 cm；V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；V 样：反应体系中加入上清液体积，0.02 mL；V 样总：ReagentⅠ体积，1 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样品质量，g；T：反应时间，2 min；n：细菌或细胞总数，以万计。

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中光径 d: 0.5 cm调整为 d: 1 cm进行计算即可。

注意事项

样本的蛋白浓度需自行测定，由于 ReagentⅠ中含有较高的蛋白浓度（约 1 mg/mL），所以测定样本蛋白浓度时需扣除提取液自身蛋白浓度。