抗坏血酸氧化酶(AAO)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或紫外分光光度计（能测 265 nm处的吸光度）
• 恒温箱、低温离心机
• 96孔 UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

• Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• Working ReagentⅡ：临用前配制，每瓶加入 5 mL去离子水充分溶解待用，配好的试剂 3天内用完。4℃避光保存。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存 1个月。

1. 植物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer捣碎，冰浴超声波破碎 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），16,000 g，4℃离心 20 min，取上清液，置冰上待测。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。因 Extraction Buffer中含有一定浓度的蛋白（约 1 mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去 Extraction Buffer本身的蛋白含量。

实验步骤

1. 酶标仪或紫外分光光度计预热 30 min以上，调节波长至 265 nm，紫外分光光度计用去离子水调零。
2. ReagentⅠ置于 25℃孵育 30 min。
3. 96孔 UV板或微量石英比色皿中，测定管加入 20 μL 样本，170 μL ReagentⅠ，10 μL Working ReagentⅡ，迅速混匀。
4. 用酶标仪在 265 nm下测定 10 s时的吸光值 A1和 2 min 10 s后的吸光值 A2，计算ΔA=A1-A2。

注意：（1）实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。（2）因是根据反应速率计算酶活，为保证每个样本的反应时间尽量一致，不推荐同时检测过多样本。（3）如果ΔA 测小于 0.001可适当加大样本量。如果ΔA 测大于 1，样本可用 Extraction Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

A. 使用 96孔 UV板测定的计算公式如下

1. 组织中 AAO活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：25℃中每 mg组织蛋白在反应体系中每分钟氧化 1 nmol的 AsA定义为一个酶活力单位。

AAO (U/mg prot)=184.5×ΔA÷Cpr

AAO (U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(Cpr×V 样)÷T=184.5×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：25℃中每 g组织在反应体系中每分钟氧化 1 nmol的 AsA定义为一个酶活力单位。

AAO (U/g鲜重)=184.5×ΔA÷W

AAO (U/g鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样÷V 样总×W)÷T=184.5×ΔA÷W

V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：AsA在 265 nm处摩尔消光系数，5.42×10⁴ L/mol/cm；d：96孔 UV板光径，0.5 cm；10⁹：1 mol=1×10⁹ nmol； V 样：加入样本体积，0.02 mL；V 样总：加入 Extraction Buffer体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g。

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中光径 d: 0.5 cm调整为 d: 1 cm进行计算即可。