谷氨酸合成酶(GOGAT)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或紫外分光光度计（能测 340 nm处的吸光度）
• 96孔 UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 制冰机、低温离心机
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

• ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• Working Solution：临用前配制，取一瓶 ReagentⅢ，向其中加入 10.8 mL ReagentⅡ，充分混匀待用，现配现用，当天用完。

试剂盒组分

样本制备

1. 组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL ReagentⅠ，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 细胞（菌）：收集 500万细胞（菌）到离心管内，用冷 PBS清洗，离心后弃上清，加入 1 mL ReagentⅠ，冰浴超声波破碎 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），然后 8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 血清（浆）样本：直接检测。

实验步骤

1. 酶标仪或紫外分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 340 nm。紫外分光光度计用去离子水调零。
2. Working Solution于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其他物种）孵育 30 min。
3. 操作表（下述操作在 96孔 UV板或微量石英比色皿中操作）：

4. 迅速混匀后，于 340 nm检测，记录 20 s和 5 min 20 s的吸光值，分别记为 A1和 A2，计算ΔA 测=A1-A2。

结果计算

A. 使用 96孔 UV板测定的计算公式

1. 血清（浆）GOGAT活力的计算

单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

GOGAT (U/mL)=[ΔA 测×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷V 样本÷T=643×ΔA 测

2. 组织中 GOGAT活力的计算

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗 1 nmol的 NADH 定义为一个酶活力单位。

GOGAT (U/mg prot)=[ΔA 测×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样本×Cpr)÷T=643×ΔA 测÷Cpr

(2) 按样本鲜重计算

单位的定义：每 g组织每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

GOGAT (U/g 鲜重)=[ΔA 测×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W÷V_ReagentⅠ×V 样本)÷T=643×ΔA 测÷W

3. 按细胞（菌）密度计算

单位的定义：每 1万个细胞（菌）每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

GOGAT (U/10⁴)=[ΔA 测×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样本÷V_ReagentⅠ×500)÷T=1.286×ΔA 测

参数说明：

• V 反总：反应体系总体积，0.2 mL=2×10^-4 L
• V_ReagentⅠ：加入 ReagentⅠ体积，1 mL
• V 样本：加入样本体积，0.02 mL
• ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm
• d：96孔 UV板直径，0.5 cm
• Cpr：蛋白浓度（mg/mL）
• T：反应时间，5 min
• W：样本质量，g
• 500：细胞（菌）总数，500万
• 10⁹：单位换算系数，1 mol=10⁹ nmol

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中的光径 d: 0.5 cm调整为 d: 1 cm进行计算即可。