维生素 C(VC)/抗坏血酸(AsA)含量检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或紫外分光光度计（能测 265 nm处的吸光度）
• 恒温箱、低温离心机
• 96孔 UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

• Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• Working ReagentⅡ：临用前配制，根据用量按照 ReagentⅡ:ReagentⅠ=1:250的体积比例充分混匀，现用现配。置于冰上待用。
• Standard：临用前配制，加入 5.679 mL去离子水充分溶解，即为 10 mmol/L AsA；吸取 40 μL溶液，加入 960 μL去离子水，混匀，即 400 μmol/L AsA。配制好的 10 mmol/L AsA 4℃避光保存，3天内使用完。

样本制备

1. 动物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心 20 min，取上清液，置冰上待测。
2. 植物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer捣碎，冰浴超声波破碎 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），8,000 g，4℃离心 20 min，取上清液，置冰上待测。
3. 细胞：收集 500万细胞到离心管内，用冷 PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细胞 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），然后 8,000 g，4℃离心 20 min，取上清液，置冰上待测。
4. 血清等液体样本：直接检测。

实验步骤

1. 酶标仪或紫外分光光度计预热 30 min以上，调节波长至 265 nm，紫外分光光度计用去离子水调零。
2. ReagentⅠ置于 25℃孵育 30 min。
3. 96孔 UV板或微量石英比色皿中，标准管加入 20 μL Standard，160 μL ReagentⅠ，20 μL Working ReagentⅡ，迅速混匀，用酶标仪在 265 nm下测定 10 s时的吸光值 A1和 2 min 10 s后的吸光值 A2，计算ΔAStandard=A1-A2。
4. 96孔 UV板或微量石英比色皿中，测定管加入 20 μL 样本，160 μL ReagentⅠ，20 μL Working ReagentⅡ，迅速混匀，用酶标仪在 265 nm下测定 10 s时的吸光值 A3和 2 min 10 s后的吸光值 A4，计算ΔA 测=A3-A4。

结果计算

A. 使用 96孔 UV板或微量石英比色皿测定的计算公式如下

1. 按蛋白浓度计算：
   
   AsA(nmol/mg prot)=(CStandard×ΔA 测÷ΔAStandard)÷Cpr=400×ΔA 测÷ΔAStandard÷Cpr
2. 按样本质量计算：
   
   AsA(nmol/g 鲜重)=(CStandard×ΔA 测÷ΔAStandard)×V 样总÷W=400×ΔA 测÷ΔAStandard÷W
3. 按细胞数量计算：
   
   AsA(nmol/104 cell)=(CStandard×ΔA 测÷ΔAStandard)×V 样总÷细胞数量=400×ΔA 测÷ΔAStandard÷细胞数量
4. 按液体体积计算：
   
   AsA (nmol/mL)=CStandard×ΔA 测÷ΔAStandard=400×ΔA 测÷ΔAStandard

CStandard：AsA浓度，400 μmol/L=400 nmol/mL；V 样总：加入 Extraction Buffer体积，1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g；细胞数量：以 104为单位计量，万。