乙醇含量检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见光分光光度计（能测 450 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管
• 水浴锅、离心机
• 去离子水
• 匀浆器或研钵（如果是组织样本）

试剂准备

ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

ReagentⅡ：临用前配制；48 T加入 3 mL Reagent III，96 T加入 6 mL Reagent III，充分溶解，用不完的试剂-20℃避光分装保存1个月，避免反复冻融。

ReagentⅢ：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

ReagentⅣ：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

注意：ReagentⅣ有一定的刺激性，建议在使用过程中做好个人防护。

Working Reagent：每孔准备 160 µLWorking Reagent，现配现用。吸取 100 µL ReagentⅠ，50 µL Reagent II 和 10 μL Reagent IV，混合均匀。

Standard：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

5 µmol/mL 标准品：临用前取 58.4 μL标准品加入 941.6 μL去离子水配成 1,000 μmol/mL的标准溶液；再取 50 μL 1,000 μmol/mL的标准溶液加入 950 μL去离子水配成 50 μmol/mL的标准溶液；再取 100 μL 50 μmol/mL的标准溶液加入 900 μL去离子水配成 5 μmol/mL的标准溶液用于下述标准孔的测定。

样本制备

注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h内完成样品解冻。

1. 组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL去离子水，冰浴匀浆，8,000 g，室温离心 10 min，取上清液待测。
2. 细菌和细胞：收集 500万细菌或细胞到离心管内，用冷 PBS清洗细菌或细胞，离心后弃上清，加入 1 mL去离子水，冰浴超声波破碎细菌或细胞 30次（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s），然后 8,000 g，室温离心 10 min，取上清液待测。
3. 血清（浆）等液体样本：直接检测。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 450 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。
2. 操作表（下述操作在 96孔板或微量玻璃比色皿中操作）：

充分混匀，记录 450 nm处吸光值 A1和 37℃避光孵育 10 min后的吸光值 A2，标准孔记为 A 标准，测定孔记为A 测定。计算ΔA=A2-A1。

注意：标准管只需做 1-2次。实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA 测定小于 0.001可适当加大样本量。如果ΔA 测定大于 0.6，样本可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

乙醇含量的计算

1. 按样本蛋白浓度计算：

乙醇(μmol/mg prot)=[C 标准×(ΔA 测定÷ΔA 标准)×V 样]÷(Cpr×V 样÷V 样总)=5×ΔA 测定÷ΔA 标准÷Cpr

2. 按样本鲜重计算：

乙醇(μmol/g 鲜重)=[C 标准×(ΔA 测定÷ΔA 标准)×V 样]÷(W×V 样÷V 样总)=5×ΔA 测定÷ΔA 标准÷W

3. 按照细菌或细胞数量计算

乙醇(μmol/104)=[C 标准×(ΔA 测定÷ΔA 标准)×V 样]÷(n×V 样÷V 样总)=5×ΔA 测定÷ΔA 标准÷n

4. 按样本体积计算：

乙醇(μmol/mL)=C 标准×(ΔA 测定÷ΔA 标准)=5×ΔA 测定÷ΔA 标准

C 标准：标准溶液的浓度，5 μmol/mL；V 样：加入反应体系中的样本体积，0.025 mL；V 样总：提取液体积，1 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；n：细菌或细胞数量，万；W：样本质量，g。