羟甲基戊二酰辅酶A合成酶(HMGCS)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见光分光光度计（能测 412 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管
• 恒温箱、制冰机、低温离心机
• 去离子水
• 匀浆器或研钵（如果是组织样本）

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

Working Reagent I：临用前配制；48 T加入 1.5 mL去离子水，96 T加入 3 mL去离子水，充分溶解，用不完的试剂-20℃避光分装保存 1个月，避免反复冻融。

Working Reagent II：临用前配制；48 T加入 1.5 mL去离子水，96 T加入 3 mL去离子水，充分溶解，用不完的试剂-20℃避光分装保存 1个月，避免反复冻融。

Reagent III：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

样本制备

注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h内完成样品解冻。

1. 组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer，用匀浆器或研钵冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液待测。
2. 细菌、细胞或真菌：收集500万细菌、细胞或真菌到离心管内，用冷PBS清洗细菌、细胞或真菌，离心后弃上清，加入1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细菌、细胞或真菌 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液待测。
3. 血清（浆）或其他液体：直接检测。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 412 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。

2. 操作表（下述操作在 96孔板或微量玻璃比色皿中依次操作）：

3. 加入样本后迅速混匀，立即记录 10s时 412 nm处吸光值 A1和 25℃孵育 4 min 10 s时 412 nm处吸光值 A2，空白孔记为 A 空白，测定孔记为 A 测定，。计算ΔA 测定=A2 测定-A1 测定，ΔA 空白=A2 空白-A1 空白，ΔA=ΔA 测定-ΔA 空白。

注意：空白孔只需做 1-2次。实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于 0.01可适当加大样本量或延长反应时间（不超过 8 min）。如果ΔA大于 0.6，样本可用 Extraction Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

HMGCS活性的计算

A. 使用 96孔 UV板测定的计算公式如下

(1) 按样本蛋白浓度计算：

酶活单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。

HMGCS (U/mg prot)=73.53×ΔA÷Cpr

(2) 按样本鲜重计算：

酶活单位定义：每克样本每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。

HMGCS (U/g 鲜重)=73.53×ΔA÷W

(3) 按细胞、细菌或真菌数量计算：

酶活单位定义：每 106个细胞、细菌或真菌每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。

HMGCS (U/106)=73.53×ΔA÷n

(4) 按液体体积计算：

酶活单位定义：每毫升液体每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。

HMGCS (U/mL)=73.53×ΔA

V 反总：反应体系总体积，0.2 mL=0.0002 L；ε：TNB 摩尔消光系数，1.36×10⁴ L /mol /cm；d：96孔板光径，0.5 cm；10⁹：1 mol=1×10⁹ nmol；V 样：加入样本体积，0.1 mL；V 样总：加入 Extraction Buffer 体积，1 mL；T：反应时间，4 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；n：细胞、细菌或真菌数量，以百万计。

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中光径 d：0.5 cm调整为 d：1 cm进行计算即可。