NAD-苹果酸酶(NAD-ME)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或紫外分光光度计（能测 340 nm处的吸光度）
• 96孔 UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 恒温水浴锅、制冰机、离心机
• 去离子水
• 研钵或匀浆器

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Working Reagent II：临用前配制；48 T加入 12 mL Reagent I，96 T加入 24 mL Reagent I，充分溶解待用；用不完的试剂-20℃分装避光可保存 4周，避免反复冻融。

Working Reagent III：临用前配制；48 T加入 1.25 mL去离子水，96 T加入 2.5 mL去离子水，充分溶解待用；用不完的试剂-20℃分装可保存 4周，避免反复冻融。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存 1个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h内完成样品解冻。

1. 动植物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，14,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 细胞或细菌：收集 1,000万细胞或细菌到离心管内，用冷 PBS清洗细胞或细菌，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细胞或细菌 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），然后 14,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 血清（浆）等液体样本：直接检测。

注意：1. 如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。
2. 该试剂盒提取的动植物组织样本也可以适用于 KTB1018的测定。

实验步骤

1. 酶标仪或紫外分光光度计预热 30 min，调节波长到 340 nm。紫外分光光度计用去离子水调零。
2. 在微量石英比色皿或 96孔 UV板中加入 10 μL样本上清和 170 μLWorking Reagent II，混匀，30℃孵育 5 min后，加入 20 μL Working Reagent III，混匀后立即记录 340 nm处初始吸光值 A1和 1 min后的吸光值 A2，计算ΔA=A2-A1。

注意：实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验，如果ΔA小于 0.005可将反应时间延长至 5 min或 10 min，即继续记录 340 nm处 5 min或 10 min后的吸光值并计算相应的ΔA，计算结果中除以实际反应时间。如果ΔA大于 0.5，样本上清液可用 Extraction Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

A. 使用 96孔 UV板测定的计算公式如下

1. 按样本蛋白浓度计算：
   单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
   NAD-ME (U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(Cpr×V 样)÷T=6,431×ΔA÷Cpr
2. 按样本鲜重计算：
   单位的定义：每 g组织每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
   NAD-ME (U/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V 样÷V 样总)÷T=6,431×ΔA÷W
3. 按细胞或细菌数量计算：
   单位的定义：每 10⁴细胞或细菌每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
   NAD-ME (U/10⁴)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(1,000×V 样÷V 样总)÷T=6.431×ΔA
4. 按液体体积计算：
   单位的定义：每mL样本每分钟生成 1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
   NAD-ME (U/mL)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷V 样÷T=6,431×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：96孔 UV板光径，0.5 cm；10⁹：1 mol=1×10⁹ nmol；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；T：反应时间，1 min；V 样：加入反应体系中样本体积，0.01 mL；V 样总：加入 Extraction Buffer体积，1 mL；W：样本质量，g；1,000：细菌或细胞总数，1,000万个。

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中光径 d: 0.5 cm调整为 d: 1 cm进行计算即可。

注意事项

1. 实验时，样本上清和 Reagent II 在冰上放置，以免变性和失活。
2. 实验中 96孔 UV板和石英比色皿中反应液的温度需保持在 30℃。