中性蛋白酶(NP)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或可见光分光光度计（能测 680 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管
• 水浴锅、低温离心机、恒温箱
• 去离子水
• 匀浆器或研钵（如果是组织样本）

试剂准备

Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

Working Reagent II：临用前配制；48 T加入 2.4 mL去离子水，96 T加入 4.8 mL去离子水，充分溶解，用不完的试剂 4℃避光可保存 3天。

Working Reagent III：临用前配制；48 T加入 5 mL Reagent I，96 T加入 10 mL Reagent I，沸水浴中磁力搅拌溶解（可在烧杯上盖一层保鲜膜，注意观察，避免水分全部蒸发，一般加热 15-30 min，该试剂为过饱和试剂，充分混匀后仍出现颗粒物不溶物不影响使用），用不完的试剂 4℃避光可保存 3天。

Working Reagent IV：临用前配制；48 T加入 12 mL去离子水，96 T加入 24 mL去离子水，充分溶解，用不完的试剂 4℃可保存 3天。

Reagent V：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

Standard：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

样本制备

1. 动物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Reagent I，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心 10 min，取上清，即粗酶液，置冰上待测。

2. 血清（浆）等液体样本：直接检测。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 680 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。

2. Working Reagent II、III、IV 于 30℃放置 30 min。

3. 操作表（下述操作在 1.5 mL离心管中操作）：

4. 取 200 μL至微量玻璃比色皿或 96孔板中，记录 680 nm处吸光值，空白孔记为 A 空白，标准孔记为 A 标准，测定孔记为 A 测定，对照孔记为 A 对照。计算ΔA 测定=A 测定-A 对照，ΔA 标准=A 标准-A 空白。

结果计算

NP活性的计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

酶活单位定义：30℃每毫克蛋白每分钟水解产生 1 nmol酪氨酸为 1个酶活单位。

（2）按样本鲜重计算：

酶活单位定义：30℃每克样品每分钟催化水解产生 1 nmol酪氨酸为 1个酶活单位。

（3）按样本体积计算：

酶活单位定义：30℃每毫升样品每分钟催化水解产生 1 nmol酪氨酸为 1个酶活单位。

C 标准品：标准酪氨酸溶液，0.25 μmol/mL=250 nmol/mL；V 反总：酶促反应总体积，0.1 mL；Cpr：粗酶液蛋白质浓度，mg/mL；V 样：加入反应体系中粗酶液体积，0.02 mL；V 提：提取液总体积，1 mL；T：催化反应时间，10 min；W：样品质量，g。