高铁还原酶(FCR)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见分光光度计（能测 562 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 恒温水浴锅、制冰机、离心机
• 去离子水、浓硫酸
• 研钵或匀浆器

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

Reagent II：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Working Reagent：临用前配制；根据实验用量将 Extraction Buffer、Reagent I、Reagent II 以 1:1:1的比例混合，现用现配。

标准品制备：

Standard：临用前配制；加入 0.71 mL去离子水和 10 μL浓硫酸，配制成 50 μmol/mL Fe²⁺标准液；配制好的标准液 4℃可以保存 2周。

注意：Standard低毒，建议在通风橱进行实验。

50 nmol/mL标准溶液：现用现配；临用前取 20 μL 50 μmol/mL Fe²⁺标准液和 980 μL去离子水混合配制成 1 μmol/mL标准溶液；再吸取 50 μL 1 μmol/mL（1,000 nmol/mL）和 950 μL去离子水混合配制成 50 nmol/mL标准溶液备用。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存 1个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h内完成样品解冻。

1. 组织样本：

称取约 0.1 g组织样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，15,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。

2. 血清（浆）等液体样本：

直接测定。若液体有浑浊则离心取上清测定。

如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热 30 min，调节波长到 562 nm。可见分光光度计用去离子水调零。
2. 空白孔测定：在微量玻璃比色皿或 96孔板中，加入 50 μL去离子水和 150 μL Working Reagent，混匀，记录吸光值 A_空白，空白孔只需做 1-2次。
3. 标准孔测定：在微量玻璃比色皿或 96孔板中，加入 50 μL 50nmol/mL Fe²⁺标准液和 150 μL Working Reagent，混匀，记录吸光值 A_标准，计算ΔA_标准=A_标准-A_空白，此时 Fe²⁺终浓度为 12.25 nmol/mL，标准孔只需做 1-2次。
4. 样本测定：在微量玻璃比色皿或 96孔板中，加入 50 μL样本上清和 150 μLWorking Reagent，混匀，记录初始吸光值 A₁和室温 30 min后的吸光值 A₂。计算ΔA_测定=A₂-A₁。

注意：实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验，如果ΔA_测定小于 0.01，可以增加样本量或者延长反应时间后再进行测定；如果ΔA_测定大于 1.5，建议将样本上清用 Extraction Buffer适当稀释后再进行测定。注意同步修改计算公式。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

1. 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟产生 1 nmol Fe²⁺-ferrozine定义为一个酶活力单位。

FCR (U/mg prot)=ΔA_测定×C_标准÷ΔA_标准×V_反总÷(V_样×C_pr)÷T=1.67×ΔA_测定÷ΔA_标准÷C_pr

2. 按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g组织每分钟产生 1 nmol Fe²⁺-ferrozine定义为一个酶活力单位。

FCR (U/g 鲜重)=ΔA_测定×C_标准÷ΔA_标准×V_反总÷(W×V_样÷V_样总)÷T=1.67×ΔA_测定÷ΔA_标准÷W

3. 按样本体积计算：

单位的定义：每mL血清（浆）每分钟产生 1 nmol Fe²⁺-ferrozine定义为一个酶活力单位。

FCR (U/mL)=ΔA_测定×C_标准÷ΔA_标准×V_反总÷V_样÷T=1.67×ΔA_测定÷ΔA_标准

C_标准：Fe²⁺标准液最终浓度，12.5 nmol/mL；V_反总：反应体系总体积，0.2 mL；V_样：加入反应体系中样本体积，0.05 mL；V_样总：加入 Extraction Buffer体积，1 mL；C_pr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，30 min。