羟基抗氧化能力(HORAC)检测试剂盒(荧光法)-CheKine™

自备耗材

• 荧光酶标仪（激发波长为 485 nm，发射波长为 525 nm）
• 全黑 96孔板、可调节式移液枪及枪头
• 低温离心机、恒温箱、制冰机
• 去离子水、PBS (pH 7.4)、丙酮
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂盒组分

试剂准备

1×Assay Buffer：使用前，Assay Buffer (2×)用去离子水稀释成 1×Assay Buffer，充分溶解待用。4℃保存。

1×ReagentⅠ：使用前，ReagentⅠ(100×)用 1×Assay Buffer稀释成 1×ReagentⅠ，充分溶解待用。用不完的 ReagentⅠ(100×)在-20℃避光分装保存，避免反复冻融。不要储存稀释的 1×ReagentⅠ溶液。

1×ReagentⅡ：使用前，ReagentⅡ(32×)用去离子水稀释成 1×ReagentⅡ，充分溶解待用。4℃避光保存。

ReagentⅢ：即用型；使用前，平衡到室温。用不完的试剂在-20℃避光分装保存，避免反复冻融。

Trolox Standard (5 mM)：使用前，用 1×Assay Buffer稀释成 0.1 mM浓度，充分溶解待用。用不完的 Trolox Standard（5 mM）-20℃避光分装保存，避免反复冻融。

Standard 设置：按下表所示，配制标准品溶液。

样本制备

1. 动物组织：称取 0.1 g样本，加入 1 mL冷的 1×Assay Buffer，冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 植物组织：称取 0.1 g样本，加入 1 mL冷的 1×Assay Buffer捣碎，冰浴超声波破碎 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 细胞或细菌：收集 500万细胞或细菌到离心管内，用冷 PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入 1 mL冷的 1×Assay Buffer，冰浴超声波破碎 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
4. 血浆或血清：用 1×Assay Buffer稀释 10倍或更多进行检测。
5. 液体样本：10,000 g，4℃离心 10 min，去除微粒，取上清液，置冰上待测。在进行测定之前，根据需要稀释上清液。
6. 亲脂性样本：亲脂性样本溶于 100%丙酮中，用 50%丙酮稀释，在室温下孵育 1 h，10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。在进行测定之前，根据需要稀释上清液。
7. 固体或高蛋白样本：称取固体样本，加入去离子水（1:2，W/V），冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心 10 min，取水溶性部分的上清液。不溶物部分用去离子水洗涤，将此洗涤液与水溶性的上清液混合，合并的上清液可以用 1×Assay Buffer稀释并直接用于分析。而不溶物部分加入纯丙酮（1:4, w/v）在室温下混合 30-60 min来进一步提取。10,000 g，4℃离心 10 min，取丙酮提取物的上清液用 50%丙酮稀释。通过将水溶性部分和不溶物部分的丙酮提取物的结果相结合，计算出总 HORAC值。

实验步骤

1. 荧光酶标仪预热到 37℃，调节激发波长为 485 nm，发射波长为 525 nm。
2. 操作表（下述操作在全黑 96孔板中操作）：

3. 混匀，立即用荧光酶标仪读取荧光值，每 5 min读取 1次，总共 60 min。荧光酶标仪的测定条件为激发波长为 485 nm，发射波长为 525 nm，仪器温度保持在 37℃。

结果计算

HORAC值根据荧光衰减曲线下净面积(Area Under the Curve, AUC)=[AUC待测样(抗氧化剂)-AUC(空白)]计算抗氧化剂的活性。

1. 从下面的等式计算 AUC

AUC=1+RFU1/RFU0+RFU2/RFU0+RFU3/RFU0+……+RFU59/RFU0+RFU60/RFU0

RFU0=0 min的相对荧光值。

RFUx=x min的相对荧光值（例如，RFU5是 5 min时的相对荧光值）。

2. 计算净 AUC：净 AUC=AUC(样本)-AUC(空白)。
3. 标准曲线的绘制：以标准品浓度为 y轴，净 AUC为 x轴，绘制标准曲线。
4. 将样本的净 AUC带入方程得到 y值（μM），以微摩尔每升 Trolox当量（TE）或每克样品的 TE（μmol TE/ g或 μmol TE/ L）表示 HORAC值。