脯氨酸脱氢酶(ProDH)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或可见光分光光度计（能测 600 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管
• 水浴锅、低温离心机
• 去离子水
• 匀浆器或研钵（如果是组织样本）

试剂准备

• Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。
• Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。
• Reagent II：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。
• Reagent III：临用前配制；48 T加入 1 mL去离子水，96 T加入 2 mL去离子水，充分溶解待用。4℃避光保存可稳定 6个月。
• Reagent IV：临用前配制；48 T加入 1 mL去离子水，96 T加入 2 mL去离子水，充分溶解待用。4℃避光保存可稳定 6个月。
• Reagent V：临用前配制；每瓶加入 0.5 mL去离子水，充分溶解，现配现用。

Working Reagent：临用前配制；根据用量按照 Reagent II（V）：Reagent III（V）：Reagent IV（V）=2.4（mL）：0.3（mL）：0.3（mL）的比例充分混匀，现配现用。

样本制备

1. 组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，1,500 g，4℃离心 15 min，取上清液于一支新的离心管中，加入一滴 ReagentⅠ（用 10 μL的枪头加入），涡旋混匀，冰浴放置 30 min后，16,000 g，4℃离心 20 min，取上清液，置冰上待测。

2. 细菌和细胞：收集 500万细菌或细胞到离心管内，用冷 PBS清洗细菌或细胞，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细菌或细胞 30次（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s），然后 1,500 g，4℃离心 15 min，于一支新的离心管中，加入一滴 ReagentⅠ（用 10 μL的枪头加入），涡旋混匀，冰浴放置 30 min后，16,000 g，4℃离心 20 min，取上清液，置冰上待测。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 600 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。
2. 将Working Reagent置于 30℃水浴预热 10 min。
3. 操作表（下述操作在 96孔板或微量玻璃比色皿中操作）：

迅速混匀，记录 600 nm处吸光值 A1和 10 min后的吸光值 A2，计算ΔA=A2-A1。

结果计算

ProDH活性的计算

（1）按样本蛋白浓度计算：

酶活单位定义：每分钟每 mg组织蛋白在每mL反应体系中使 600 nm处吸光值变化 0.005定义为一个酶活力单位。

（2）按样本鲜重计算：

酶活单位定义：每分钟每 g组织在每 mL反应体系中使 600 nm处吸光值变化 0.005定义为一个酶活力单位。

（3）按照细菌或细胞数量计算

酶活单位定义：每分钟每 104细菌或细胞在每 mL反应体系中使 600 nm处吸光值变化 0.005定义为一个酶活力单位。

V 反总：反应体系总体积，0.2 mL；V 样：加入的样本体积，0.035 mL；V 样总：提取液体积，1 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间，10 min；n：细菌或细胞数量，以万计；W：样本质量，g。