鸟氨酸转氨酶(δ-OAT)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见光分光光度计（能测 340 nm处的吸光度）
• 96孔 UV板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管
• 水浴锅、低温离心机
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

• Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。
• Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。
• Reagent II：临用前配制；48 T加入 4 mL ReagentⅠ，96 T加入 8 mL ReagentⅠ，充分溶解；用不完的试剂 4℃避光保存 1个月。
• Reagent III：临用前配制；48 T加入 4 mL ReagentⅠ，96 T加入 8 mL ReagentⅠ，充分溶解；用不完的试剂 4℃避光保存 1个月。
• Reagent IV：临用前配制；每瓶加 10 mL ReagentⅠ，充分溶解，-20℃分装保存；-20℃避光保存一周。

样本制备

注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h内完成样品解冻。

1. 组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 细菌：收集 500万细菌到离心管内，用冷 PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细菌 3 min（功率 30%或 300 W，超声 3 s，间隔 7 s），然后 10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 血清（浆）等液体样本：直接检测。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3002的蛋白质定量试剂盒（Bradford法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 340 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。
2. 将配好的 Reagent II、III、IV 37℃预热 5 min。
3. 操作表（下述操作在微量石英比色皿/96孔 UV板中操作）：

混匀后，测定 340 nm处 10 s时的吸光度 A1，迅速置于 37℃避光孵育 10 min，测定 10 min 10 s时的吸光度 A2，测定孔记为 A，计算ΔA =A1-A2。

注意：加入样本时开始计时，将试剂依次加入后应尽量快速混匀并测定 OD值，减少误差时间。实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于 0.01可适当加大样本量。如果ΔA大于 0.5，样本可用 Extraction Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

δ-OAT活性的计算：

1. 按样本蛋白浓度计算：

酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

δ-OAT(nmol/min/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(V 样×Cpr)÷T=321.54×ΔA÷Cpr
2. 按样本鲜重计算：

酶活单位定义：每克组织每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

δ-OAT(nmol/min/g 鲜重)=ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T=321.54×ΔA÷W
3. 按照细菌数量计算

酶活单位定义：每 104个细菌每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

δ-OAT(nmol/min/104 cell)=ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(V 样×n÷V 样总)÷T=321.54×ΔA÷n
4. 按样本体积计算：

酶活单位定义：每毫升液体每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

δ-OAT(nmol/min/mL)＝ΔA÷(ε×d)×V 反总÷V 样÷T=321.54×ΔA

V 反总：反应体系总体积，0.2mL；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.02mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；n：细菌数量