焦磷酸：果糖-6-磷酸-1-磷酸转移酶(PFP)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3 个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或紫外分光光度计（能测 340 nm 处的吸光度）
• 96 孔 UV 板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 恒温水浴锅、分析天平、制冰机、低温离心机
• 去离子水
• 研钵或匀浆器

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

注意：Extraction Buffer 有刺激性气味，Reagent I 有毒且有刺激性气味，建议在通风橱进行实验。

Working Reagent II：临用前配制；48 T 加入 1.2 mL 去离子水，96 T 加入 2.4 mL 去离子水，充分溶解待用；用不完的试剂-20℃分装避光可保存 2 周，避免反复冻融。

Working Reagent III：临用前配制；48 T 加入 1.2 mL 去离子水，96 T 加入 2.4 mL 去离子水，充分溶解待用；用不完的试剂-20℃分装避光可保存 2 周，避免反复冻融。

Reagent IV：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

Reagent V：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

Reagent VI：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存 2 周。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h 内完成样品解冻。

1. 动植物组织：称取约 0.1 g 样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 细胞：收集 500 万细胞到离心管内，用冷 PBS 清洗细胞，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细胞 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30 次），然后 10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 血清（浆）等液体样本：直接检测。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine 货号：KTD3002 的蛋白质定量试剂盒（Bradford 法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或紫外分光光度计预热 30 min，调节波长到 340 nm。紫外分光光度计用去离子水调零。
2. 取微量石英比色皿或 96 孔 UV 板，依次加入 100 μL Reagent I，20 μL Reagent II，20 μL Reagent III，10 μL Reagent IV，10 μL Reagent V，20 μL Reagent VI，20 μL 粗酶液，充分混匀，记录 340 nm 处初始值 A1 和 15 min 的吸光值 A2，计算 ΔA=A1-A2。

注意：也可将 Reagent I、Reagent II、Reagent III、Reagent IV、Reagent V 和 Reagent VI 按上述比例，配制成工作液，现配现用；每次检测样本数不宜太多以免耽误过多的酶促反应时间。如果 ΔA 小于 0.01 可增大样本量或适当延长反应时间，计算结果中除以实际反应时间。如果 ΔA 大于 0.5，样本上清液可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

A. 使用 96 孔 UV 板测定的计算公式如下

1. 按样本蛋白浓度计算：

   单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

   PFP (U/mg prot)=117.89×ΔA÷Cpr

   PFP (U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(Cpr×V 样)÷T

2. 按样本鲜重计算：

   单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

   PFP (U/g 鲜重)=117.89×ΔA÷W

   PFP (U/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V 样÷V 样总)÷T

3. 按细胞数量计算：

   单位的定义：每 10⁴ 细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

   PFP (U/10⁴)=117.89×ΔA÷N

   PFP (U/10⁴)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(N×V 样÷V 样总)÷T

4. 按液体体积计算：

   单位的定义：每 mL 样本每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

   PFP (U/mL)=117.89×ΔA

   PFP (U/mL)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷V 样÷T

V 反总：反应体系总体积，2.2×10^-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：96 孔 UV 板光径，0.5 cm；10⁹：1 mol=1×10⁹ nmol；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；T：反应时间，15 min；V 样：加入反应体系中样本体积，0.04 mL；V 样总：加入 Extraction Buffer 体积，1 mL；W：样本质量，g；N：细胞总数，10⁴。

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中光径 d: 0.5 cm 调整为 d: 1 cm 进行计算即可。

注意事项

1. 实验时，样本上清和试剂均在冰上放置，以免变性和失活。