β-葡萄糖醛酸苷酶(β-GD)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见光分光光度计（能测 540 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管
• 水浴锅、低温离心机
• 去离子水
• 匀浆器或研钵

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

Reagent II：临用前配制；48 T加入 1.2 mL去离子水，96 T加入 2.4 mL去离子水，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光保存 1个月。

Reagent III：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

Standard：即用型；1 μmol/mL标准储备液；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

样本制备

注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h内完成样品解冻。

动物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 540 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。
2. 操作表（下述操作在 96孔板或微量玻璃比色皿中操作）：

3. 充分混匀，记录 540 nm处吸光值，空白孔记为 A 空白，标准孔记为 A 标准，测定孔记为 A 测定。计算ΔA 测定=A 测定-A 空白，ΔA 标准=A 标准-A 空白。

注意：空白管和标准管只需做 1-2次。实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA 测定小于 0.02可适当加大样本量。如果ΔA 测定大于 1.5，样本可用 Extraction Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

β-GD活性的计算

(1) 按样本蛋白浓度计算：

酶活单位定义：每毫克蛋白每小时催化产生 1 nmol酚酞的量定义为一个酶活力单位。

β-GD(U/mg prot)=2,000×ΔA 测定÷ΔA 标准÷Cpr

(2) 按样本鲜重计算：

酶活单位定义：每克样本每小时催化产生 1 nmol酚酞的量定义为一个酶活力单位。

β-GD(U/g 鲜重)=2,000×ΔA 测定÷ΔA 标准÷W

C 标准：标准溶液的浓度，1 μmol/mL；V 样：加入的样本体积，0.01 mL；V 样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间，0.5 h；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；1,000，换算系数，1 μmol=1,000 nmol。

注意事项

样本的蛋白浓度需自行测定，由于 Extraction Buffer中含有较高的蛋白浓度（约 1 mg/mL），所以测定样本蛋白浓度时需扣除提取液自身蛋白浓度。