L-半乳糖苷-1,4-内酯脱氢酶(Gal LDH)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见光分光光度计（能测 550 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管
• 水浴锅、低温离心机
• 去离子水
• 匀浆器或研钵

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Working ReagentⅠ：临用前配制；48 T加入 9.6 mL去离子水，96 T加入 19.2 mL去离子水，充分溶解。配制好的试剂置于 4℃避光保存，3天内用完。

Working Reagent II：临用前配制；48 T加入 1.2 mL去离子水，96 T加入 2.4 mL去离子水，充分溶解。配制好的试剂置于 4℃避光保存，3天内用完。

样本制备

注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h内完成样品解冻。

植物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆后超声波 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，破碎 30次），然后 13,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 550 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。
2. Working ReagentⅠ置于 25℃预热 30 min。
3. 操作表（下述操作在 96孔板或微量玻璃比色皿中操作）：

4. 迅速混匀，记录 550 nm处 10 s时吸光值 A1，25℃反应 2 min记录 130 s时的吸光值 A2。测定孔记为 A 测定，空白孔记为 A 空白，计算ΔA=(A2 测定-A1 测定)-(A2 空白-A1 空白)。

注意：空白管只需做 1-2次。实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于 0.01可适当加大样本量。如果ΔA大于 0.8，样本可用 Extraction Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

Gal LDH活性的计算

A. 使用 96孔板测定的计算公式如下

(1) 按样本蛋白浓度计算：

酶活单位定义：25℃时，每毫克蛋白每分钟还原 1 nmol Cyt c定义为一个酶活力单位。

Gal LDH (U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样×Cpr)÷T=578.03×ΔA÷Cpr

(2) 按样本鲜重计算：

酶活单位定义：25℃时，每克样本每分钟还原 1 nmol Cyt c定义为一个酶活力单位。

Gal LDH (U/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V 样÷V 样总)÷T=578.03×ΔA÷W

V 反总：反应体系总体积，0.2 mL=0.0002 L；ε：Cyt c摩尔消光系数，17.3×10³ L /mol /cm；d：96孔板光径，0.5 cm；10⁹：1 mol=1×10⁹ nmol；V 样：加入样本体积，20 μL=0.02 mL；V 样总：加入 Extraction Buffer体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。

B. 使用微量玻璃比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中光径 d：0.5 cm调整为 d：1 cm进行计算即可。