酪氨酸解氨酶(TAL)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或紫外分光光度计（能测 333 nm处的吸光度）
• 96孔 UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 恒温水浴锅、制冰机、离心机、恒温箱
• 去离子水
• 研钵或匀浆器

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Reagent II：临用前配制；取一瓶 Reagent II 向其中加入 14 mL Reagent I，充分溶解，在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 10 min以上；用不完的试剂 4℃避光可保存一周。

Reagent III：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

样本制备

1. 组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 细胞或细菌：收集 500万细胞或细菌到离心管内，用冷 PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细胞或细菌 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），然后 8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 血清（浆）等液体样本：直接检测。

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热 30 min，调节波长到 333 nm。紫外分光光度计用去离子水调零。
2. 酶促反应（下述操作在 1.5 mL EP管中进行）：

充分混匀，40℃孵育 60 min

混匀，10,000 g，4℃离心 5 min，取 200 μL上清液至微量石英比色皿或 96孔 UV板中，于 333 nm处测定吸光值，分别记为 A测定、A 对照，计算ΔA=A 测定-A 对照。

结果计算

1. 按蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg组织蛋白在反应体系中每min使 333 nm处吸光值变化 0.005定义为一个酶活力单位。

TAL (U/mg prot)=ΔA×V 反总÷(Cpr×V 样)÷0.005÷T=35×ΔA÷Cpr

TAL (U/mg prot)=35×ΔA÷Cpr

2. 按样本鲜重计算：

定义：每 g组织在反应体系中每 min使 333 nm处吸光值变化 0.005定义为一个酶活力单位。

TAL (U/g 鲜重)=ΔA×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷0.005÷T=35×ΔA÷W

TAL (U/g 鲜重)=35×ΔA÷W

3. 按细胞或细菌数量计算

定义：每 104个细菌或细胞在反应体系中每 min使 333 nm处吸光值变化 0.005定义为一个酶活力单位。

TAL (U/104)=ΔA×V 反总÷(500×V 样÷V 样总)÷0.005÷T=0.07×ΔA

TAL (U/104)=0.07×ΔA

4. 按样本体积计算

定义：每 mL血清（浆）在反应体系中每 min使 333 nm处吸光值变化 0.005定义为一个酶活力单位。

TAL (U/mL)=ΔA×V 反总÷V 样÷0.005÷T=35×ΔA

TAL (U/mL)=35×ΔA

V 反总：反应体系总体积，0.42 mL；V 样：加入反应体系中样本体积，0.04 mL；V 样总：加入 Extraction Buffer体积，1 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间，60 min；W：样本鲜重，g；500：细菌或细胞总数，500万。