己糖激酶(HK)活性检测试剂盒(紫外法)-CheKine™

自备仪器与试剂

试剂盒组分

*请在实验前检查各组分的量。

*各组分在规格基础上额外提供 10%的量用于进行标准曲线制作或预实验。

注意事项

• 正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。
• 对于组织样本及细胞样本等，可通过测定蛋白浓度来进行样本间结果均一化。推荐使用亚科因货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）。
• 本试剂盒兼容分光光度计检测，请按照分光光度计检测要求按比例调节检测试剂配制量。如有疑问，可咨询本司技术人员（400-6800-830）。
• 生化检测试剂普遍具有刺激性、生物毒性等，为了您的安全和健康，请在实验全程做好生物安全防护，穿戴实验服、口罩、手套、头套等安全护具，在通风橱、生物安全柜中进行实验。
• 本产品仅供科学研究使用，不适用于临床诊断。

实验流程

试剂准备

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，样本经过冻存后 HK活性会显著降低。

• 动植物组织：称取约 0.1 g组织样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，8000 g，4℃离心 10 min，取上清置冰上待测。
• 细胞、细菌或真菌样本：收集 5×10⁶个细胞、细菌或真菌，用预冷的生理盐水清洗细胞、细菌或真菌，800 g离心 2 min，弃上清。加入 1 mL Extraction Buffer进行冰浴超声破碎。超声波破碎 5 min（功率 20%或200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），4℃，8000 g离心 10 min，取上清置于冰上待测。
• 血清（浆）：直接测定。

实验步骤

1. 酶标仪准备：预热 30 min以上，调节波长到 340 nm。
2. 工作液的配制：临用前配制；每孔需要 190 μL工作液，为避免损失，可多配制 2孔用量。按照 190 µL每单孔体系配制：分别吸取 180 μL Working Reagent Ⅱ和 10 μL Working Reagent Ⅲ混匀。工作液需现配现用，测定前在 37℃孵育 10 min。
3. 检测体系配制：在 96孔 UV板中按照如下方式操作

4. 吸光度检测：加入工作液后，立即混匀测定 340 nm处第 10 s时的吸光值 A1和 37℃准确孵育 10 min后第 10 min 10 s时的吸光值 A2。

结果计算

自动计算

为帮助您更轻松、准确地完成相关计算，我们特在官网提供了"在线计算器小工具"。您无需手动计算，只需在网页上输入数值，即可快速获得可靠结果。访问方式：官网[https://www.abbkine.cn] > 进入"技术中心"> 查找"在线计算器"工具。

手动计算

以下为您提供的推导过程计算公式和简洁计算公式，两者完全相等。

1. 数据处理

计算ΔA=A2-A1。

2. 样本 HK活性计算

• 按样本质量计算

酶活单位定义：每克样品每分钟生成 1 nmol NADPH定义为 1个酶活单位。

HK (U/g)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样÷V 样总×W)÷T×n=643.09×ΔA÷W×n

• 按细胞、细菌或真菌数量计算:

酶活单位定义：每 10⁴个细胞、细菌或真菌每分钟生成 1 nmol NADPH定义为 1个酶活单位。

HK (U/10⁴)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样÷V 样总×500)÷T×n=643.09×ΔA÷500×n

• 按液体体积计算

酶活单位定义：每毫升液体每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为 1个酶活单位。

HK (U/mL)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样÷V 样总)÷T×n=643.09×ΔA×n

• 按蛋白浓度计算

酶活单位定义：每毫克蛋白每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为 1个酶活单位。

HK (U/mg)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样×Cpr)÷T×n=643.09×ΔA÷Cpr×n

ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：96 孔 UV板光径，0.5 cm；10⁹：1 mol=1×10⁹ nmol；V 反总：反应体系总体积，200 μL=2×10^-4 L；V 样：加入反应体系中上清液体积，10 μL=1×10^-5 L；V 样总：加入 Extraction Buffer体积，1 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样品质量，g；T：反应时间，10 min；500：细胞、细菌或真菌数量，5×10⁶，以 10⁴为单位；n：样本稀释倍数。