丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3 个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或紫外分光光度计（能测 340 nm 处的吸光度）
• 96 孔 UV 板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 恒温水浴锅、分析天平、制冰机、低温离心机
• 去离子水
• 研钵或匀浆器

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Working Reagent II：临用前配制；取 Reagent II 一瓶加入 12 mL Reagent I 和一瓶 Reagent III，充分混匀；用不完的试剂分装后 -20℃避光可保存 4 周，禁止反复冻融。

注意：Reagent II 有毒且有刺激性气味，建议在通风橱进行实验。

Reagent III：即用型；使用前，平衡到室温，体积较少，若沾在管壁上，临用前可低速离心后使用；4℃避光保存。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存 2 周。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h 内完成样品解冻。

植物组织：称取约 0.1 g 样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine 货号：KTD3001 的蛋白质定量试剂盒（BCA 法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或紫外分光光度计预热 30 min，调节波长到 340 nm。紫外分光光度计用去离子水调零。
2. 根据实验用量，将 Working Reagent II 置于 37℃水浴 5 min。
3. 在微量石英比色皿或 96 孔 UV 板中加入 10 μL 样本上清和 190 μL Working Reagent II，混匀，立即记录 340 nm 处初始吸光值 A1 和 10 min 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A1-A2。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验，如果 ΔA 小于 0.03 可增大样本量或适当延长反应时间，计算结果中除以实际反应时间。如果 ΔA 大于 0.5，样本上清液可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

A. 使用 96 孔 UV 板测定的计算公式如下

1. 按样本蛋白浓度计算：

   单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

   PPDK (U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(Cpr×V 样)÷T=643×ΔA÷Cpr

2. 按样本鲜重计算：

   单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

   PPDK (U/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V 样÷V 样总)÷T=643×ΔA÷W

V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：96 孔 UV 板光径，0.5 cm；10⁹：1 mol=1×10⁹ nmol；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；T：反应时间，10 min；V 样：加入反应体系中样本体积，0.01 mL；V 样总：加入 Extraction Buffer 体积，1 mL；W：样本质量，g。

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中光径 d: 0.5 cm 调整为 d: 1 cm 进行计算即可。

注意事项

1. 实验时，样本上清和 Working Reagent II 在冰上放置，以免变性和失活。