磷酸丙糖异构酶(TPI)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或紫外光分光光度计（能测 340 nm处的吸光度）
• 96孔 UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管
• 水浴锅、低温离心机
• 去离子水
• 匀浆器或研钵（如果是组织样本）

试剂准备

Extraction BufferⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Extraction Buffer II：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

Reagent II：临用前配制；48 T加入 1.2 mL去离子水，96 T加入 2.4 mL去离子水，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存1个月，避免反复冻融。

Reagent III：临用前配制；48 T加入 1.2 mL去离子水，96 T加入 2.4 mL去离子水，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存1个月，避免反复冻融。

Reagent IV：临用前配制；48 T加入 1.2 mL去离子水，96 T加入 2.4 mL去离子水，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存1个月，避免反复冻融。

样本制备

植物组织：

1. 总 TPI提取：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction BufferⅠ，冰浴匀浆后超声波破碎 30次（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s），然后 8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 胞浆和叶绿体 TPI的分离：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction BufferⅠ，冰浴匀浆后 200 g，4℃离心 5 min，弃沉淀，取上清 8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液用于测定胞浆 TPI活性，取沉淀加入 1 mL Extraction Buffer II，震荡溶解后超声波破碎 30次（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s），然后 8,000 g，4℃离心 10 min，取上清用于测定叶绿体 TPI活性。

实验步骤

1. 酶标仪或紫外光分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 340 nm，紫外光分光光度计用去离子水调零。
2. ReagentⅠ置于 37℃预热 10 min。
3. 操作表（下述操作在 96孔 UV板或微量石英比色皿中依次操作）：

4. 充分混匀，记录 340 nm处 10 s时吸光值 A1，37℃反应 5 min记录 310 s时的吸光值 A2。计算ΔA=A2-A1。

结果计算

TPI活性的计算

A. 使用 96孔 UV板测定的计算公式如下

(1) 按样本蛋白浓度计算：

酶活单位定义：每毫克蛋白每分钟消耗 1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

(2) 按样本鲜重计算：

酶活单位定义：每克样本每分钟消耗 1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

参数说明：

• V 反总：反应体系总体积，0.2 mL
• ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L /mol /cm
• d：96孔 UV 板光径，0.5 cm
• V 样：加入样本体积，0.02 mL
• V 样总：加入提取液体积 II，1 mL
• T：反应时间，5 min
• Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL
• W：样本质量，g

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中光径 d：0.5 cm调整为 d：1 cm进行计算即可。