磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或紫外分光光度计（能测 340 nm处的吸光度）
• 96孔 UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 制冰机、低温离心机、水浴锅
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂盒组分

试剂准备

• Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• Working Solution：临用前配制，临用前将 ReagentⅡ、ReagentⅢ和 Reagent IV 转移到 ReagentⅠ中混合溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃避光保存一周，禁止反复冻融。
• Working Reagent V：临用前配制，48 T加 0.6 mL去离子水，96 T加 1.2 mL去离子水，充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃避光保存一周，禁止反复冻融。

样本制备

1. 动物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 植物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer捣碎，冰浴超声波破碎 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 细胞或细菌：收集 500万细胞或细菌到离心管内，用冷 PBS清洗，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细胞或细菌 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），然后 8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
4. 血清（浆）样本：直接检测。

实验步骤

1. 酶标仪或紫外分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 340 nm。紫外分光光度计用去离子水调零。
2. 将Working Solution和Working Reagent V 置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）预热 5 min。
3. 操作表（下述操作在 96孔 UV板或微量石英比色皿中操作）：

迅速混匀后，于 340 nm检测，测定孔分别记录 20 s和 1 min 20 s的吸光值，记为 A1和 A2，计算ΔA 测=A1-A2。

结果计算

A. 使用 96孔 UV板测定的计算公式

1. 血清（浆）PEPCK活力的计算

单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

PEPCK (U/mL)=[ΔA 测×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷V 样本÷T=6,430.87×ΔA 测

2. 组织中 PEPCK活力的计算

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg组织蛋白每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

PEPCK (U/mg prot)=[ΔA 测×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样本×Cpr)÷T=6,430.87×ΔA 测÷Cpr

(2) 按样本鲜重计算

单位的定义：每 g组织每分钟消耗 1 nmol的 NADH 定义为一个酶活力单位。

PEPCK (U/g 鲜重)=[ΔA 测×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W÷V_{Extraction Buffer}×V 样本)÷T=6,430.87×ΔA 测÷W

3. 按细胞或细菌密度计算

单位的定义：每 1万个细胞或细菌每分钟消耗 1 nmol的 NADH 定义为一个酶活力单位。

PEPCK (U/10⁴)=[ΔA 测×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样本÷V_{Extraction Buffer}×500)÷T=12.86×ΔA 测

V 反总：反应体系总体积，0.2 mL=2×10^-4 L，V_{Extraction Buffer}：加入 Extraction Buffer体积，1 mL；V 样本：加入样本体积，0.01 mL；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：96孔 UV板直径，0.5 cm；Cpr：蛋白浓度（mg/mL）；T：反应时间，1 min；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万；10⁹：单位换算系数，1 mol=10⁹ nmol。

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中的光径 d: 0.5 cm调整为 d: 1 cm进行计算即可。