亚铁离子含量检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见光分光光度计（能测 593 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管
• 恒温箱、制冰机、低温离心机
• 去离子水、氯仿
• 匀浆器或研钵（如果是组织样本）

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。为避免污染，建议将 Reagent I 分装后使用。

Reagent II：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

Standard：临用前配制；每瓶 Standard加入 2040 μL Reagent II 充分溶解，即 10 µmol/mL Fe²⁺标准品；现用现配。使用 10 µmol/mL Fe²⁺标准品，按照下表所示，进一步稀释成标准品：

注意：每次实验都要做一次标准品检测，制作标曲；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在 4小时内使用。

样本制备

注意：建议使用新鲜样本。亚铁离子易被氧化，样本放置时间较长或反复冻融会造成结果不准确。

1. 组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer，用匀浆器或研钵冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。

2. 血清（浆）等液体样本：取 125 μL样本，加入 125 μL Extraction Buffer混合均匀（即稀释 2倍），置冰上待测。如果样本浑浊，5,000 g，4℃离心 5 min，取上清液，置冰上待测。

注意：1. 本试剂盒提取液不能用于蛋白含量测定，如需测定蛋白含量，用去离子水重新提取样本后进行蛋白浓度测定。如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

2. 为避免铁污染，所有的样本处理和转移操作不要使用铁制器具。如有需要，可用 1%稀盐酸浸泡处理所用器具 4 h。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 593 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。

2. 操作表（下述操作在 1.5 mL EP管中操作）：

充分混匀，37℃孵育 10 min，流水冷却至室温，空白管和标准管取 200 μL至 96孔板或微量玻璃比色皿中，记录 593 nm处吸光值。测定管进行以下操作：

充分涡旋震荡 2 min，10,000 g，室温离心 5 min，小心吸取上层无机相 200 μL至 96孔板或微量玻璃比色皿中，记录 593 nm处吸光值

3. 空白孔记为 A 空白，标准孔记为 A 标准，测定孔记为 A 测定。计算ΔA 测定=A 测定-A 空白，ΔA 标准=A 标准-A 空白。

注意：1. 空白管和标准管只需做 1-2次。实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA 测定小于 0.01可适当加大样本量。如果ΔA 测定大于 0.6，样本可用 Extraction Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。2. 每次检测不要超过三个样本，反应完成后需立即完成吸光值检测，避免造成实验误差。3. 氯仿会腐蚀 96孔板，所以在吸取上层无机相时注意不要吸到下层氯仿。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

1. 标准曲线的绘制

以标准溶液浓度为 x轴，ΔA 标准为 y轴，绘制标准曲线，得到标准方程，将ΔA 测定带入方程得到 x (nmol/mL)。

2. 亚铁离子含量的计算：

（1）按蛋白浓度计算

亚铁离子(nmol/mg 蛋白)=(V 样×x)÷(V 样×Cpr)=x÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

亚铁离子(nmol/g 鲜重)=(V 样×x)÷(W×V 样÷V 样总)=x÷W

（3）按样本体积计算：

亚铁离子(nmol/mL)=F×x=2x

V 样：加入反应体系中样本体积，0.2 mL；V 样总：加入 Extraction Buffer体积，1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；F：液体样本稀释倍数，2。