D-乳酸(D-LA)含量检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或可见分光光度计（能测 450 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 恒温箱、制冰机、离心机
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂盒组分

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Reagent I：即用型；整个实验过程中，冰上放置；用不完的试剂分装保存于-20℃，禁止反复冻融。

Reagent II：即用型；整个实验过程中，冰上放置；用不完的试剂分装保存于-20℃，禁止反复冻融。

Reagent III：即用型；整个实验过程中，冰上避光放置；用不完的试剂分装避光保存于-20℃，禁止反复冻融。

Reagent IV：即用型；整个实验过程中，冰上避光放置；用不完的试剂分装避光保存于-20℃，禁止反复冻融。

Working Reagent：每孔准备 55 µL工作液，现配现用：吸取 31 µL Extraction Buffer，8 µL Reagent II，5 µL Reagent III，1 µL Reagent IV 和 10 μL Reagent I，混合均匀。

Standard (100 μmol/mL)：取 10 µL Standard用 990 μL Extraction Buffer稀释至 1 μmol/mL，混合均匀；平衡到室温；用不完的 Standard (100 μmol/mL)分装保存于-20℃。

标准品制备：使用 1 μmol/mL标准品，按照下表所示，进一步稀释标准品：

样本制备

1. 动植物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL预冷的 Extraction Buffer，冰浴匀浆，12,000 g，4℃离心 5 min，取上清液，置冰上待测。

2. 细菌或细胞：收集 500万细胞或细菌到离心管内，用冷 PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细胞 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），然后 12,000 g，4℃离心 5 min，取上清液，置冰上待测。

3. 血清（浆）：直接检测。

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热 30 min，调节波长到 450 nm。可见分光光度计用去离子水调零。

2. 操作表（下述操作在 96孔板或微量玻璃比色皿中进行）：

3. 混匀后，37℃避光孵育 30 min，测定 450 nm处吸光度，分别记为 A 测定、A 标准、A 空白，计算ΔA 测定=A 测定-A 空白、ΔA 标准=A 标准-A 空白。

结果计算

1. 标准曲线的绘制

以标准溶液浓度为 x轴，ΔA 标准为 y轴，绘制标准曲线，得到标准方程，将ΔA 测定带入方程得到 x (μmol/mL)。

2. D-乳酸含量的计算

（1）按样本鲜重计算

乳酸含量 (μmol/g 鲜重)=x×V 样÷(W×V 样÷V 样总)×n=x÷W×n

（2）按蛋白浓度计算

乳酸含量 (μmol/mg 蛋白)=x×V 样÷(V 样×Cpr)×n=x÷Cpr×n

（3）按样本体积计算

乳酸含量 (μmol/mL)=x×V 样÷V 样×n=x×n

（4）按细胞或细菌数量计算

乳酸含量 (μmol/104)=x×V 样÷(500×V 样÷V 样总)×n=x÷500×n

V 样：加入样本体积，0.05 mL；W：样本质量，g；V 样总：加入 Extraction Buffer体积，1 mL；n：样本稀释倍数；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；500：细胞或细菌总数，500万。