DPPH自由基清除能力试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或可见分光光度计（能测 515 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 烘干箱、涡旋振荡仪、低温离心机、30~50目筛
• 去离子水、无水乙醇
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前预冷；4℃保存。

试剂盒组分

Working ReagentⅠ：临用前配制；48 T试剂盒用 30 mL无水乙醇充分溶解 Reagent I 后转移至Working ReagentⅠ瓶中，96 T试剂盒用 60 mL无水乙醇充分溶解 Reagent I 后转移至Working ReagentⅠ瓶中；用不完的试剂-20℃分装避光保存一个月，禁止反复冻融。

Vitamin C Working Reagent (Positive Control)：临用前配制；加入 1 mL Extraction Buffer，充分溶解，配制成 10 mg/mL的维生素 C溶液，4℃可保存两周，用于阳性对照。

阳性对照的准备：若需要线性关系，建议先将 10 mg/mL的维生素 C Working Reagent用 Extraction Buffer稀释 10倍成 1 mg/mL，然后配制成 0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625 mg/mL的维生素 C溶液待用，稀释可参考下表：

样本制备

1. 植物样本的制备：将新鲜样本置于 60℃烘箱烘干至恒重，研钵研碎（或粉碎机粉碎），过 30~50目筛；称取约 0.05 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer进行冰浴匀浆，然后 10,000 g，4℃离心 10 min，取上清，置于冰上待测。
2. 红酒、果汁等液体样本：吸取 100 μL样本溶液加入 900 μL Extraction Buffer，旋涡振荡混匀，然后 10,000 g，4℃离心 10 min，取上清，置于冰上待测。

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热 30 min，调节波长到 515 nm。可见分光光度计用无水乙醇调零。
2. 操作表（下述操作在 96孔板或微量玻璃比色皿中进行）：

充分混匀，室温避光反应 20 min后测定 515 nm处吸光值，分别记为 A 测定、A 对照、A 阳性对照、A 空白。

结果计算

1. 阳性对照的自由基清除率计算公式：

DPPH自由基清除率（DVC%）=[(A 空白-A 阳性对照)÷A 空白]×100%

2. 样本的自由基清除率计算公式：

DPPH自由基清除率（D%）=[[A 空白-(A 测定-A 对照)]÷A 空白]×100%

注意事项

1. 尽量避免使用在酸性条件下呈红色或接近红色的试剂，否则对本试剂盒的检测结果产生干扰。
2. 样品中不宜添加Tween、Triton和NP-40等去垢剂和DTT、巯基乙醇等影响氧化还原反应的还原剂。
3. 若液体样本为碱性，需要用Extraction Buffer稀释至酸性后再检测。
4. 不同样本清除DPPH自由基的能力可能相差很大，如果要比较不同样本的DPPH自由基清除能力，建议加入等量的同一批样本进行检测。
5. 样本建议当天提取当天检测。