柠檬酸(CA)含量测定试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或可见光分光光度计（能测 545 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管
• 水浴锅、低温离心机
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

Reagent II：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

Reagent III：即用型；使用前，平衡到室温。为易挥发试剂，用完后尽快密封，-20℃避光保存。

Working Reagent IV：临用前配制；48 T加入 1.25 mL ReagentⅠ，96 T加入 2.5 mL ReagentⅠ，充分溶解，用不完的试剂 4℃避光保存 2周。

Reagent V：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

Standard：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

样本制备

1. 组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL ReagentⅠ，冰浴匀浆，11,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 细菌和细胞：收集 500万细菌到离心管内，用冷 PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入 1 mL ReagentⅠ，冰浴超声波破碎细菌 3 min（功率 30%或 300 W，超声 3 s，间隔 7 s），然后 11,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 线粒体中柠檬酸提取：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL ReagentⅠ，冰浴匀浆，600 g，4℃离心 5 min；取上清至另一离心管中，11,000 g，4℃离心 10 min，弃上清（此上清液可用于细胞质 CA含量测定）；向沉淀中加 200 μL Reagent II，以及 2 μL Reagent III，充分悬浮溶解，11,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
4. 血清（浆）等液体样本：取 0.1 mL液体加 0.9 mL ReagentⅠ，充分混匀，11,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 545 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。
2. 将 ReagentⅠ置于 30℃预热 30 min。
3. 操作表（下述操作在微量石英比色皿/96孔板中操作）：

混匀后，室温静置 30 min，测定 545 nm处的吸光度，空白孔记为 A 空白，标准孔记为 A 标准，测定孔记为 A 测定。计算ΔA 测定=A 测定-A 空白，ΔA 标准=A 标准-A 空白。

结果计算

CA含量的计算：

1. 按样本蛋白浓度计算：
   CA(μmol/mg prot)=C 标准×ΔA 测定÷ΔA 标准×V 样本÷(Cpr×V 样本)=2×ΔA 测定÷ΔA 标准÷Cpr
2. 按样本鲜重计算：
   CA(μmol/g 鲜重)=C 标准×ΔA 测定÷ΔA 标准×V 总÷W=2×ΔA 测定÷ΔA 标准÷W
3. 按照细菌数量计算
   CA(μmol/104 cell)=C 标准×ΔA 测定÷ΔA 标准×V 总÷n=2×ΔA 测定÷ΔA 标准÷n
4. 按样本体积计算：
   CA(μmol/mL)=C 标准×ΔA 测定÷ΔA 标准×F=20×ΔA 测定÷ΔA 标准

C 标准：标准品的浓度，2 μmol/mL；V 样本：加入的样本体积，0.02 mL；V 样总：上清液总体积；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；n：细胞数量；F：样本稀释倍数，(0.1 mL样本+0.9 mL ReagentⅠ)÷0.1 mL样本=10