NADP磷酸酶(NADPase)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或可见分光光度计（能测 660 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 恒温水浴锅、制冰机、离心机、恒温箱
• 去离子水
• 研钵或匀浆器

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Working Reagent II：临用前配制；取一支加入 1.2 mL Reagent I 充分溶解备用（每支可做 30 T，为延长使用时间，48 T准备了 2支，96 T准备了 4支，现用现配）。

Working Reagent III：临用前配制；48 T加入 12.5 mL 去离子水，96 T加入 25 mL 去离子水，充分溶解待用，4℃避光可保存一周。

Working Reagent IV：临用前配制；48 T加入 12.5 mL 去离子水，96 T加入 25 mL 去离子水，充分溶解待用，若较难溶解可37℃水浴 10 min促进溶解，4℃避光可保存一周。

Reagent V：即用型；使用前，平衡到室温；室温保存。

Standard：10 μmol/mL标准磷储备液，即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

0.5 μmol/mL Standard：取 50 μL Standard加入 950 μL去离子水，充分混匀，稀释成 0.5 μmol/mL标准磷应用液，4℃保存。

Working Reagent：按去离子水：Working Reagent III：Working Reagent IV：Reagent V=2:1:1:1的比例配制，根据实验用量现用现配，配好的Working Reagent应为浅黄色，若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染。

样本制备

组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热 30 min，调节波长到 660 nm。可见分光光度计用去离子水调零。

2. 酶促反应（下述操作在 1.5 mL EP管中进行）：

置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）预热 5 min

37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）准确反应 30 min后，95℃水浴 5 min（盖紧，以防止水分散失），冷却后，10,000 g, 25℃离心 5 min，取上清。

3. 定磷（下述操作在 96孔板或微量玻璃比色皿中进行）：

混匀，25℃静置 30 min，于 660 nm处测定吸光值，分别记为 A 测定、A 对照、A 标准、A 空白，计算ΔA 测定=A 测定-A 对照、ΔA 标准=A 标准-A 空白。

结果计算

1. 按组织蛋白浓度计算：

单位的定义：每小时每 mg组织蛋白中 NADPase分解 NADP产生 1 μmol无机磷的量为一个 NADPase活力单位。

2. 按样本鲜重计算：

定义：每小时每 g组织中 NADPase分解 NADP产生 1 μmol无机磷的量为一个 NADPase活力单位。

C 标准：0.5 μmol/mL的磷标准应用液；V 总：酶促反应总体积，0.2 mL；V 样：加入反应体系中样本体积，0.04 mL；V 样总：加入 Extraction Buffer体积，1 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间，0.5 h；W：样本鲜重，g。