葡萄糖-6-磷酸酶(G6P)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或紫外分光光度计（能测 340 nm处的吸光度）
• 恒温箱、低温离心机
• 96孔 UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Working Reagent：临用前配制，将 ReagentⅡ、ReagentⅢ、Reagent IV、Reagent V、Reagent VI 全部转移到 ReagentⅠ中，充分溶解待用，用不完的试剂分装后-20℃保存两周，禁止反复冻融。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存 1个月。

1. 动物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 植物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer捣碎，冰浴超声波破碎 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 血清（浆）等液体：直接测定。

注意：

1. 如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。
2. 该试剂盒提取的动植物组织样本也可以适用于 KTB1013的测定。

实验步骤

1. 酶标仪或紫外分光光度计预热 30 min以上，调节波长至 340 nm，紫外分光光度计用去离子水调零。
2. Working Reagent置于 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）孵育 5 min。
3. 96孔 UV板或微量石英比色皿中加入 10 μL 样本，190 μL Working Reagent，迅速混匀。
4. 用酶标仪在 340 nm下测定 10 s时的吸光值 A1和 2 min 10 s后的吸光值 A2，计算ΔA=A2-A1。

注意：实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于 0.001可适当加大样本量。如果ΔA大于 0.3，样本可用 Extraction Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

A. 使用 96孔 UV板测定的计算公式如下

1. 血清（浆）中 G6P活力的计算:

单位的定义：每mL血清（浆）在反应体系中每分钟消耗 1 nmol的 NADH 定义为一个酶活力单位。

2. 组织中 G6P活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗 1 nmol的 NADH 定义为一个酶活力单位。

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g组织在反应体系中每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

参数说明：

• V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L
• ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm
• d：96孔板光径，0.5 cm
• 10⁹：1 mol=1×10⁹ nmol
• V 样：加入样本体积，0.01 mL
• V 样总：加入提取液体积，1 mL
• T：反应时间，2 min
• Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL
• W：样品质量

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中光径 d: 0.5 cm调整为 d: 1 cm进行计算即可。