葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或紫外分光光度计（能测 340 nm处的吸光度）
• 96孔 UV微孔板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

• Assay Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• 6-Phosphogluconic Acid Working Regent：临用前，用 2.4 mL Assay Buffer溶解管内组分，混合均匀。使用时，请置于冰上。配制好的 6-Phosphogluconic Acid Working Regent 4℃避光可保存 1周。
• NADP+Working Regent：临用前，用 2.4 mL Assay Buffer溶解管内组分，混合均匀。使用时，请置于冰上。配制好的 NADP+Working Regent 4℃避光可保存 1周。

试剂盒组分

样本制备

1. 动物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Assay Buffer，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 植物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Assay Buffer捣碎，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 细胞或细菌：收集 2,000万细胞或细菌到离心管内，用冷 PBS清洗细胞，12,000 g，4℃离心 1 min弃上清，加入 1 mL Assay Buffer，冰浴超声波破碎细胞或细菌 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
4. 血清（浆）等液体样本：直接测定。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或紫外分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 340 nm，紫外分光光度计用去离子水调零。
2. Assay Buffer置于 25℃或者 37℃水浴预热 30 min以上。
3. 取 96孔 UV板，按如下方式进行加样：

4. 混匀后，于 340 nm处测定 3 min内吸光值变化，空白孔第 10 s吸光值记为 A1，第 190 s吸光值记为 A2，ΔA 空白=A2-A1；测定孔第 10 s吸光值记为 A3，第 190 s吸光值记为 A4，ΔA 测定=A4-A3。

注意：实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA 测定小于 0.002可适当加大样本量。如果ΔA 测定大于 0.6，样本可用 Assay Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

A. 使用 96孔 UV板测定的计算公式

1. 按照液体体积计算：每毫升液体样本每分钟催化产生 1 μmol NADPH的酶量为 1 U。

G6PDH酶活性(U/mL)=1.0718×(ΔA 测定-ΔA 空白)

2. 按蛋白浓度计算：每毫克蛋白每分钟催化产生 1 μmol NADPH的酶量为 1 U。

G6PDH酶活性(U/mg prot)=1.0718×(ΔA 测定-ΔA 空白)÷Cpr

3. 按样本鲜重计算：每克组织每分钟催化产生 1 μmol NADPH的酶量为 1 U。

G6PDH酶活性(U/g)=1.0718×(ΔA 测定-ΔA 空白)÷W

4. 按细菌或细胞密度计算：每 1万个细菌或细胞每分钟生成 1 μmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

G6PDH酶活性(μmol/min/104)＝0.0005359×(ΔA 测定-ΔA 空白)

ΔA 测定：A4-A3；ΔA 空白：A2-A1；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：96孔 UV板光径，0.5 cm；10⁶：1 mol=10⁶μmol；V 样：加入样本体积，0.02 mL；V 反总：反应体系总体积，0.0002 L；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；V 样总：样本制备加入 Assay Buffer体积，1 mL；W：样本鲜重，g；T：反应时间，3 min；2,000：细菌或细胞总数，2,000万。

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中的光径 d: 0.5 cm调整为 d: 1 cm进行计算即可。