萤火虫荧光素酶检测试剂盒

自备耗材

• 细胞培养板、可调节式移液枪及枪头
• 去离子水，PBS
• 低温离心机、96 孔全黑酶标板或全白酶标板
• 发光检测仪或多功能酶标仪

试剂准备

Lysis Buffer：临用前配制，内含不溶物，摇匀后使用，用去离子水将 Lysis Buffer (5×) 稀释 5倍得到 Lysis Buffer，-20℃保存。

Firefly Luciferase Solution：临用前配制，用 Firefly Luciferase Assay Buffer溶解 Firefly Luciferase Substrate，然后将其全部加入 Firefly Luciferase Assay Buffer瓶中，充分混匀后按使用需求分装，并避光保存于-80℃。

注意：Firefly Luciferase Solution 不能反复冻融，若单次实验用量较少，建议按单次使用量分装成小规格，-20℃避光保存，推荐 3个月内使用，-80℃避光保存，12个月内有效。

实验步骤

1. 在合适的孔板上培养细胞后进行转染并用适当的方法处理细胞。
2. 细胞裂解：
   1. 将培养基移除，加 PBS轻轻洗涤细胞 2次（贴壁细胞进行此操作，悬浮细胞可直接离心收集细胞），吸弃 PBS，按如下方案加入 Lysis Buffer。

   孔板类型	96孔板	48孔板	24孔板	12孔板	6孔板
   Lysis Buffer (μL)	100	150	200	300	500

   注意：Lysis Buffer使用前摇匀，如荧光素酶的表达水平较低，可适当减少 Lysis Buffer用量，如 24孔板每孔加入 100 μL，6孔板每孔加入 200 μL。

   2. 细胞置于摇床上震荡 5-10 min，充分裂解细胞。
   3. 将细胞裂解产物 10,000 rpm离心 2 min，取上清用于检测。

   注意：细胞裂解后可立即检测荧光素酶活性，也可以冻存，需要时再进行检测，冻存样品需融解至室温再进行检测。

3. 小心吸取 20-100 µL细胞裂解上清（如果样品量足够，请加入 100 µL，如果样品量不足可以适当减少用量，但同批样品的使用量应保持一致）至检测管或 96孔全黑/全白酶标板中，将 100 µL平衡至室温的 Firefly Luciferase Solution加入检测管或酶标板中，迅速混匀后，立即于发光检测仪或多功能酶标仪中检测 Firefly Luciferase报告基因活性。

注意事项

1. 由于温度对酶反应有影响，所以测定时，样品和试剂均需达到室温后再进行检测。
2. 为取得最佳测定效果，在用单管的化学发光仪测定时，每个样品和测定试剂混合后到测定前的时间应尽量控制一致；使用具有化学发光测定功能的多功能荧光酶标仪时，宜先把样品全部加好，然后统一加入 Firefly Luciferase Solution。
3. 检测时需使用全黑色或白色的 96孔板，防止相邻孔的干扰。
4. 萤火虫荧光素酶催化的生物发光的最强波长为 560 nm。