亮氨酸氨基肽酶(LAP)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或可见分光光度计（能测 405 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 离心机、水浴锅、超声破碎仪
• 去离子水、冰
• 匀浆器或研钵

试剂准备

Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Reagent II：临用前配制；对于 48 T，临用前加入 9 mL Reagent I；对于 96 T，临用前加入 18 mL Reagent I；充分溶解待用(较难溶解时，可 60℃水浴加热约 30 min促进溶解)，用不完的试剂-20℃分装避光保存 1个月，禁止反复冻融。

试剂盒组分

样本制备

1. 动植物组织：称取约 0.1 g组织，加入 1 mL Reagent I（组织质量（g）：Reagent I 体积(mL)为 1：10）进行冰浴匀浆，然后 10,000 g，4℃离心 10 min，取上清置于冰上待测。
2. 细胞或细菌：收集 500万细胞或细菌到离心管内，用预冷 PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入 1 mL Reagent I，冰浴超声波破碎细胞或细菌 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），然后 8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 血清（浆）：直接检测。

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热 30 min，调节波长到 405 nm。可见分光光度计用去离子水调零。
2. 酶促反应（下述操作在 96孔板或微量玻璃比色皿中进行）：

充分混匀后于 405 nm处测定 30 s时的吸光值 A1，迅速置于 37℃水浴 3 min（有控温功能的酶标仪可以将温度调至 37℃），拿出迅速擦干测定 210 s时的吸光值 A2，计算ΔA=A2-A1。

结果计算

LAP活力单位的计算：

A.用 96孔板测定的计算公式如下

1、血清（浆）LAP活力的计算:

单位的定义：每mL血清（浆）每分钟生成 1 nmol的对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

2、组织、细菌或细胞中 LAP活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成 1 nmol对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g组织每分钟生成 1 nmol对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 10⁴个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

V 反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：对硝基苯胺摩尔消光系数，9.72×10³L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5 cm；10⁹：1 mol=1×10⁹ nmol；V 样：加入样本体积，0.05 mL；V 样总：加入 Reagent I 体积，1 mL；T：反应时间，3 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

B.使用微量玻璃比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中光径 d: 0.5 cm调整为 d: 1 cm进行计算即可。