活细胞示踪试剂盒（绿色荧光）实验操作流程

原理   研究细胞运动和定位，需要用到对活细胞无毒的专一性探针。Live Cell Tracking Kit提供了一种通用且保存良好的细胞跟踪试剂（Cell Tracker Green），用于监测细胞的移动，位置，增殖，迁移，趋化性和侵袭性。Cell Tracker Green 是一种活细胞荧光示踪探针，可以通过被动扩散进入细胞，与细胞内蛋白共价结合，是一种长效细胞示踪染料。一旦进入细胞，非荧光性的Cell Tracker Green会被胞内酯酶水解，产生绿色荧光（Ex/Em=494/521nm）。这些荧光产物只能积聚在具有完整细胞膜的细胞中，因此死细胞和无完整细胞膜不能被染色。Cell Tracker Green对 pH 变化不敏感，可以由甲醛或戊二醛固定。Cell Tracker Green探针可以在活细胞中保留好几代，并可以显示荧光至少一周。探针可被转移到子细胞，但是不转移到群体中的相邻细胞。
自备耗材
·24孔板、可调节式移液枪及枪头·离心机·荧光显微镜或流式细胞仪·去离子水、PBS
试剂准备
Cell Tracker Green：冰上操作，避光分装保存，避免反复冻融。1×Assay Buffer：用去离子水把5×Assay Buffer稀释到1×Assay Buffer。使用前加热到37℃。Staining Solution：实验开始之前，将Cell Tracker Green以1：1000的比例稀释到1×Assay Buffer中。相应地扩大剂量以进行大样本量测定。使用前避光并预热至37℃。注意: 对于不同的细胞类型和/或实验条件，应根据经验确定Cell Tracker Green的最终浓度。通常，长期染色（超过约3天）或使用快速分裂的细胞将需要1：1000的稀释度以使染料浓度加倍。对于较短的实验（例如生存力测定），可能需要使用浓度低至1：5000稀释的染料。为了维持正常的细胞生理状态并减少潜在的伪影，应将染料的浓度保持在尽可能低的水平。
实验步骤
A. 流式细胞仪定量1. 用所需的方法处理细胞，并建立平行对照组；注意：平行对照组建议：未染色的细胞（即不加Cell Tracker Green的细胞），用1×Assay Buffer悬浮；2. 对于非贴壁细胞，通过离心（4℃，300 g，5 min）收集0.5-1×106个细胞。用预冷的PBS洗涤两次，并丢弃PBS。 对于贴壁细胞，首先使用胰蛋白酶（不含EDTA）消化细胞，然后离心；3. 将细胞沉淀重悬于500 uL Staining Solution中；4. 黑暗条件下，37℃孵育细胞15-30 min；5. 以500 g离心细胞，并弃去上清液；6. 沉淀重悬在新鲜的预热培养基中，再孵育细胞30 min，以确保与探针完全接触，并再次用PBS洗涤细胞；7. 以5×105到1×106细胞/ml的密度将细胞沉淀重悬在预热的PBS中，并立即使用FL1通道（通常为FL1），通过流式细胞仪分析细胞。B. 荧光显微镜检测1. 对于非贴壁细胞：按照步骤A.1到步骤A.7进行流式细胞术，将步骤A.7的细胞悬液放在载玻片上。用玻璃盖玻片盖住细胞。尽快使用适当的滤光片通过荧光显微镜分析细胞。如果要固定和透化细胞，请继续执行步骤B.3。2. 对于贴壁细胞：建议的方案如下（1）用24孔培养皿直接培养细胞。染色前，在37℃的CO2培养箱中培养至少24 h；（2）用所需的方法处理细胞；（3）用PBS洗涤细胞两次并丢弃PBS；（4）向细胞中加入0.5 mL Staining Solution，并在黑暗中于37℃孵育15-30 min；（5）弃去上清液，换上预热的新鲜生长培养基，然后在黑暗中于37℃下再孵育30 min；（6）用PBS或适当的缓冲液洗涤细胞两次。 如果要固定和透化细胞，请继续进行步骤B.3； （7）使用合适的滤光片进行观察。3. 固定和透化（1）使用含醛的固定剂进行固定。通常，我们使用3.7%甲醛在室温下将细胞固定15 min；（2）固定后，用PBS洗细胞3次；（3）固定后，如果随后要用抗体检测细胞，应将其在冰冷的丙酮中孵育10 min以使细胞通透，通透后，用PBS洗细胞3次。

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Catalog No.	Product Name
KTA2020	细胞周期染色分析试剂盒
KTA1001	活/死细胞双染色试剂盒