酸性蛋白酶(ACP)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见光分光光度计（能测 680 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管
• 水浴锅、低温离心机
• 去离子水
• 匀浆器或研钵（如果是组织样本）

试剂准备

Reagent I：临用前配制；按 LiquidⅠ：Liquid II：去离子水=90（μL）：20（μL）：21（mL）的比例配制，现配现用。出现白色絮状沉淀则不能用。

Working Reagent II：临用前配制；48 T加入 2.4 mL去离子水，96 T加入 4.8 mL去离子水，充分溶解，用不完的试剂 4℃避光保存 3天。

Working Reagent III：临用前配制；48 T加入 5 mL Reagent I，96 T加入 10 mL Reagent I，沸水浴中磁力搅拌溶解（可在烧杯上盖一层保鲜膜，注意观察，避免水分全部蒸发，一般加热 15-30 min，该试剂为过饱和试剂，充分混匀后仍出现颗粒物不溶物不影响使用），用不完的试剂 4℃避光保存 3天。

Working Reagent IV：临用前配制；48 T加入 12 mL去离子水，96 T加入 24 mL去离子水，充分溶解，用不完的试剂 4℃避光保存 3天。

Reagent V：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

注意：Reagent II 有刺激性气味，Reagent V有毒，建议在通风橱进行实验。

Stardard：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

样本制备

注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h内完成样品解冻。

1. 动物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Reagent I，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心 10 min，取上清，即粗酶液，置冰上待测。
2. 细菌和真菌：收集 500万细菌或真菌到离心管内，用冷 PBS清洗细菌或真菌，离心后弃上清，加入 1 mL Reagent I，冰浴超声波破碎细菌或真菌 3 min（功率 30%或 300 W，超声 3 s，间隔 7 s），然后 8,000 g，4℃离心 10 min，取上清，即粗酶液，置冰上待测。
3. 血清（浆）等液体样本：直接检测。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 680 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。
2. Reagent II、III、IV 于 30℃放置 30 min。
3. 操作表（下述操作在 1.5 mL离心管中操作）：

4. 取 200 μL至微量玻璃比色皿或 96孔板中，记录 680 nm处吸光值 ，空白孔记为 A 空白，标准孔记为 A 标准，测定孔记为 A 测定，对照孔记为 A 对照。计算ΔA 测定=A 测定-A 对照，ΔA 标准=A 标准-A 空白。

注意：(1) 空白管和标准管只需做 1-2次。实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。(2) 如果反应较弱，ΔA 测定小于 0.002 可适当加大样本量，或延长反应时间（20-30 min），即第一步水浴时间，最后计算酶活时对公式进行修改。如果ΔA 测定大于 0.5，样本可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

ACP活性的计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

酶活单位定义：30℃每毫克蛋白每分钟水解产生 1 nmol酪氨酸为 1个酶活单位。

（2）按样本鲜重计算：

酶活单位定义：30℃每克样品每分钟催化水解产生 1 nmol酪氨酸为 1个酶活单位。

（3）按照细菌或真菌数量计算

酶活单位定义：30℃每 104个细菌或真菌每分钟催化水解产生 1 nmol酪氨酸为 1个酶活单位。

（4）按样本体积计算：

酶活单位定义：30℃每毫升样品每分钟催化水解产生 1 nmol酪氨酸为 1个酶活单位。

C 标准品：0.25 μmol/mL标准酪氨酸溶液；V 反总：酶促反应总体积，0.1 mL；Cpr：粗酶液蛋白质浓度，mg/mL；V 反：加入反应体系中粗酶液体积，0.04 mL；V 提：提取液总体积，1 mL；T：催化反应时间，10 min；W：样品质量，g；n：细菌或真菌数量。