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活动截止时间：2024年1月31日
CheKine™ 果胶酶活性检测试剂盒（微量法）(CheKine™ Micro Pectinase Activity Assay Kit) 是一套基于比色法的微量体系，可在 96 孔板内快速测定植物、微生物及细胞培养液中总果胶酶活性，为细胞代谢研究提供简便、高通量的数据支持。
背景信息
果胶酶(pectinase)是一类能够水解果胶质的复合酶系，包含原果胶酶、果胶酯酶、多聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶四大类，广泛分布于植物果实、细菌、真菌及细胞培养液中。在细胞代谢层面，果胶酶通过降解细胞壁中的果胶，参与细胞壁重构、细胞分离及营养释放等关键过程。CheKine™ 果胶酶活性检测试剂盒（微量法）利用果胶酶水解果胶生成具有还原性醛基的半乳糖醛酸，后者与 DNS 试剂反应生成红棕色物质，在 540 nm 处产生特征吸收峰；540 nm 吸光值的变化与果胶酶活性成正比，可在 2 h 内完成检测，适用于植物组织匀浆、细菌/真菌培养上清及细胞培养液等样本。
应用领域
细胞代谢研究、植物细胞壁降解机制探索、微生物发酵过程监控、细胞培养工艺优化等。
| 中文名称 | 果胶酶活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™ |
| 英文名称 | CheKine™ Micro Pectinase Activity Assay Kit |
| 产品货号 | KTB1581 |
| 检测方法 | 比色法 |
| 试剂盒组分 | •Extraction Buffer •Reagent I •Reagent Ⅱ •Reagent Ⅲ •Standard |
| 分子 | Trehalose |
| 检测指标 | Trehalose |
| 注意事项 | •推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存数周。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在4 h内完成样品解冻。 •实验开始前，确保所有的组分及设备处于合适的温度。 |
| 保存建议 | 4℃，避光保存 6 个月 |
| 运输条件 | 冰袋运输（蓝冰） |
| 警告 | 本文列出的产品仅供研究使用，不适用于人类或临床诊断。我们产品所推荐应用，不是建议使用我们的产品去违反任何专利或许可证。对于使用本产品可能发生的专利侵权或其他违规行为，我们不承担任何责任。 |
注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。
Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
Working Reagent II：临用前配制；取一瓶 Reagent II 加入 10.5 mL Reagent I，50℃加热溶解，用不完的试剂 4℃避光保存一周。
Reagent III：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
注意：Reagent III 有毒，建议在通风橱进行实验。
Standard：临用前配制；加入 0.978 mL去离子水溶解，配成 50 μmol/mL半乳糖醛酸溶液备用，4℃避光可保存一周。
| 序号 | Standard体积 | 去离子水体积（µL） | 浓度（μmol/mL） |
|---|---|---|---|
| Std.1 | 100 µL 50 μmol/mL Standard | 400 | 10 |
| Std.2 | 80 µL 50 μmol/mL Standard | 420 | 8 |
| Std.3 | 60 µL 50 μmol/mL Standard | 440 | 6 |
| Std.4 | 40 µL 50 μmol/mL Standard | 460 | 4 |
| Std.5 | 20 µL 50 μmol/mL Standard | 480 | 2 |
| Std.6 | 10 µL 50 μmol/mL Standard | 490 | 1 |
| Std.7 | 5 µL 50 μmol/mL Standard | 495 | 0.5 |
| Std.8 | 0 | 500 | 0（空白管） |
注意：每次实验都要做一次标准品检测，制作标曲；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在 4小时内使用。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存数周。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h内完成样品解冻。
1. 植物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer进行冰浴匀浆。10,000 g, 4℃离心 10 min，取上清，置冰上待测。
2. 细菌或真菌：收集 500万细菌或真菌到离心管内，用冷 PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细菌或真菌 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），然后 10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 细胞培养液等液体样本：直接检测。
注意：1. 如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。
2. 植物果实组织建议将样本用 Extraction Buffer稀释 10倍或 20倍后再测定。
1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min，调节波长到 540 nm。可见光分光光度计用去离子水调零。
2. 取 40 μL样本沸水浴 10 min备用。
3. 操作表（下述操作在 1.5 mL EP管中进行）：
| 试剂 | 对照管（μL） | 测定管（μL） | 标准管（μL） |
|---|---|---|---|
| Working Reagent II | 120 | 120 | 120 |
| 50℃水浴温育 | 5 min | 5 min | 5 min |
| 样本 | 0 | 30 | 0 |
| 煮沸样本 | 30 | 0 | 0 |
| Standard | 0 | 0 | 30 |
| 混匀，置于 50℃水浴反应 | 30 min | 30 min | 30 min |
| Reagent III | 150 | 150 | 150 |
沸水浴 5 min，冰浴冷却终止反应，8,000 g，4℃，离心 10 min，蒸馏水调零，取 200 μL上清于微量玻璃比色皿或 96孔板测定 540 nm处吸光值，分别记为 A 对照、A 测定、A 标准和 A 空白，计算ΔA 测定=A 测定-A 对照，ΔA 标准=A 标准-A 空白。
注意：标准曲线和空白管只需测 1-2次，每个测定管需设一个对照管。实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本的ΔA 测定小于 0.05，可适当增大样本量，如果ΔA 测定大于 1.5，样本可用 Extraction Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。每次实验冷却时间一致。
注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。
1. 标准曲线的绘制
以标准溶液浓度为 x轴，ΔA 标准为 y轴，绘制标准曲线，得到标准方程，将ΔA 测定带入方程得到 x (μmol/mL)。
2. 果胶酶活性的计算
（1）按样本蛋白浓度计算
单位定义：在 50℃，pH 3.5条件下，每 mg蛋白每小时分解果胶产生 1 μmol半乳糖醛酸为一个酶活力单位。
果胶酶 (U/mg prot)=x×V 反总÷(V 样×Cpr÷V 样总)÷T×F=10×x÷Cpr×F
（2）按样本质量计算
单位定义：在 50℃，pH 3.5条件下，每 g组织每小时分解果胶产生 1 μmol半乳糖醛酸为一个酶活力单位。
果胶酶 (U/g 质量)=x×V 反总÷(V 样×W÷V 样总)÷T×F=10×x÷W×F
（3）按细菌或真菌数量计算
单位定义：在 50℃，pH 3.5条件下，每 104个细菌或真菌每小时分解果胶产生 1 μmol半乳糖醛酸为一个酶活力单位。
果胶酶 (U/104)=x×V 反总÷(V 样×N÷V 样总)÷T×F=10×x÷N×F
（4）按液体样本体积计算
单位定义：在 50℃，pH 3.5条件下，每 mL液体每小时分解果胶产生 1 μmol半乳糖醛酸为一个酶活力单位。
果胶酶 (U/mL)=x×V 反总÷V 样÷T×F=10×x×F
V 反总：反应总体积，0.15 mL；V 样：反应中样本体积，0.03 mL；V 样总：加入 Extraction Buffer体积，1 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，0.5 h；N：细菌或真菌数量，104；F：样本稀释倍数。
A: 动物研究，植物研究，微生物研究等相关单位都应用比较多。
A: 生化试剂盒已充分验证，适合于植物、动物和微生物等多种物种。 对于在植物、动物和微生物等不同材料之间确实存在很大差异的指标，尤其是酶活性测定指标，我们分别研发和生产了针对同一指标的不同类型试剂盒，并在试剂盒名称和代号上做了明确区分，请用户仔细核对，选择合适的试剂盒类型。如有疑问，请联系support@abbkine.com，进行深入探讨。
A: 不建议用，分光光度计每次检测的样本个数不超过4个，无法做到数据检测的同步。
A: 检测孔的数量=样本个数+标准品数×重复次数+预留补测数量，如有疑问，请联系support@abbkine.com，进行深入探讨。
A: 可以，用超声进行破碎微生物细胞，再进行细胞上清的检测，如有疑问，请联系support@abbkine.com，进行深入探讨。
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