Caspase-6 活性分析试剂盒(比色法)

Name: Caspase-6 活性分析试剂盒(比色法)
Brand: Abbkine
SKU: KTA3024
Price: 489 CNY
Availability: InStock

Caspase-6 Assay Kit (Colorimetric)

产品货号

KTA3024

产品特点：

简单优化的实验方案，仅需3步反应即可完成检测

包含即用型反应缓冲液和显色底物，操作方便快捷

可特异性检测细胞凋亡早期/中期阶段的Caspase-6活性变化

选择规格

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活动截止时间：2024年1月31日

产品概述

亚科因生物研发的Caspase-6 活性分析试剂盒（比色法） (Caspase-6 Assay Kit, Colorimetric) 是一种基于Ac-VEID-pNA底物裂解的比色检测体系，可在96孔板中快速、直观地测定细胞裂解液中Caspase-6的活性，为研究细胞凋亡/周期提供可靠工具。

Caspase全称为含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase)，是一类在人类中已鉴定出11种成员的蛋白酶家族。根据序列同源性可分为3个亚族：Caspase-1亚族（Caspase-1、4、5、11）、Caspase-2亚族（Caspase-2、9）和Caspase-3亚族（Caspase-3、6、7、8、10）。其中Caspase-3、6、7作为细胞凋亡/周期的执行者，在凋亡信号传导中发挥关键作用。本试剂盒通过检测Caspase-6特异性底物Ac-VEID-pNA的裂解产物pNA在405 nm处的吸光度变化，定量反映Caspase-6活性。

应用领域

适用于细胞凋亡机制研究、药物筛选、肿瘤学研究以及细胞周期调控分析等细胞生物学实验场景。

产品参数

中文名称	Caspase-6 活性分析试剂盒(比色法)
英文名称	Caspase-6 Assay Kit (Colorimetric)
产品货号	KTA3024
检测类型	比色法
试剂盒组分	• Cell 裂解缓冲液 • 反应缓冲液 (2×) • Ac-VEID-pNA (4mM) • pNA(10mM) • DTT (100×)
保存建议	请参阅说明书中各个组件的存储条件，自发货之日起，按照推荐的保存条件，有效期为12个月。
运输条件	冰袋运输（蓝冰）
警告	本文列出的产品仅供研究使用，不适用于人类或临床诊断。我们产品所推荐应用，不是建议使用我们的产品去违反任何专利或许可证。对于使用本产品可能发生的专利侵权或其他违规行为，我们不承担任何责任。

使用说明

自备耗材

酶标仪（能测 405 nm处的吸光度）
96孔板
低温离心机、制冰机
可调节式移液枪及枪头
去离子水、磷酸盐缓冲液 (PBS)
匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

Working Cell Lysis Buffer: 使用前，立即加入 DTT（最终浓度：每 1 mL Cell Lysis Buffer加 10 µL DTT（100×）），置于冰上；4℃保存。

Working Reaction Buffer (1×): 使用前，用去离子水稀释到 Reaction Buffer (1×)，再加入 DTT（最终浓度：每 1 mL Reaction Buffer (1×)加 10 µL DTT（100×）），置于冰上；4℃保存。

Ac-VEID-pNA (4 mM): 即用型；使用前，置于冰上；–20℃保存。用不完的试剂-20℃避光分装保存，避免反复冻融。

pNA (10 mM): 即用型；使用前，置于冰上；–20℃避光保存。用不完的试剂-20℃避光分装保存，避免反复冻融。

DTT (100×): 即用型；使用前，置于冰上；–20℃保存。用不完的试剂-20℃分装保存，避免反复冻融。

Standard设置：

按下表所示，用 Reaction Buffer (1×，含 DTT)将标准品 pNA (10 mM) 稀释为 200、100、50、25、12.5、0 µM的标准溶液。

序号	标准品体积	Reaction Buffer (1×，含 DTT) (µL)	标准品浓度（μM）
Std.1	6 µL pNA (10 mM)	294	200
Std.2	150 µL of Std.1 (200 μmol/mL)	150	100
Std.3	150 µL of Std.2 (100 μmol/mL)	150	50
Std.4	150 µL of Std.3 (50 μmol/mL)	150	25
Std.5	150 µL of Std.4 (25 μmol/mL)	150	12.5
Std.6	0	150	0

注意：每次实验都要做一次标准品检测，制作标曲；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在 4小时内使用。

样本准备

注意：我们建议使用新鲜样品。或按照"样本制备"将样品保存在-80℃。使用前，在冰上解冻，这可能会影响样品的稳定性，并且读数可能会低于预期。此试剂盒可检测蛋白水解活性。在样品制备步骤中请勿使用蛋白酶抑制剂，它可能会干扰测定。

通过所需方法诱导细胞凋亡。同时，建议对每个 Caspase-6比色测定法设置不诱导的对照培养。
对于贴壁细胞，胰蛋白酶消化收集细胞。600 g，4℃离心 5 min，小心吸去上清液。用 1 mL PBS洗涤细胞 2次。离心后，去除上清液。在 50 µL Working Cell Lysis Buffer中重悬 1-5×10⁶个细胞。
对于悬浮细胞，600 g，4℃离心 5 min，小心吸去上清液。用 1 mL PBS洗涤细胞 2次。离心后，去除上清液。在 50 µL Working Cell Lysis Buffer中重悬 1-5×10⁶个细胞。
对于组织，将 5-20 mg组织切成小块，用 PBS清洗组织，加入 0.1 mL Working Cell Lysis Buffer，冰浴匀浆。
裂解物冰上孵育 15-20 min。
16,000 g，4℃离心 15 min，然后将上清液转移至新试管中，置冰上待测。
立即测定 Caspase-6的酶活性或-80℃保存样品。同时可以取少量样品用 Bradford法测定蛋白浓度。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3002的蛋白质定量试剂盒（Bradford法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪预热 30 min以上，调节波长到 405 nm。

2. 操作表（下述操作在 96孔板中操作）：

空白孔（μL）	测定孔（μL）	对照孔（μL）	标准孔（μL）
Working Reaction Buffer (1×，含 DTT)	100	50	55	0
Standard	0	0	0	100
上清	0	50	50	0
Ac-VEID-pNA (4mM)	5	5	0	0

混匀，37℃孵育 1-2 h，检测 405 nm处吸光值。空白孔记为 A 空，测定孔记为 A 测，对照孔记为 A 对。计算ΔA 测=A 测-A 空。仅组织样本需要设置对照孔，对于组织样本，ΔA 测=A 测-A 对。

立即检测 405 nm处吸光值，计算ΔA 标 =A 标-AStd.6，AStd.6为不含 pNA的标准孔的吸光值。

注意：1.空白孔和标准孔只需测定 1-2 次。实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验；2.对于组织样本，样本本身有颜色，需要设置对照孔，细胞样本一般不需要设置对照孔；3.在反应体系中，适当混匀，注意避免在混匀时产生气泡；4.发现颜色变化比较明显时即可测定 405 nm的波长。如果颜色变化不明显，可以适当延长孵育时间至 4 h。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

1. 按标准曲线计算

以标准溶液浓度为 x轴，ΔA 标为 y轴，绘制标准曲线 y=kx+b。将样本的ΔA 测带入方程得到 x值（μM）。

2. 按酶活性增加百分比计算

Caspase-6活性增加百分比=(实验处理组 A 测定-A 空白)/(实验对照组 A 测定-A 空白)×100%

该方法简单可靠，可粗略反应酶活性情况。

3. 按酶活计算

参考 Chemicon公司的Caspase酶活力单位的定义：One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric pNA-substrate per hour at 37℃ under saturated substrate concentrations。即一个酶活力单位定义为当底物饱和时,在 37℃一个小时内可以剪切 1 nmol pNA底物产生 1 nmol游离 pNA的酶量。这样就可以计算出样品中含有多少个酶活力单位的 Caspase酶活性。

Caspase-6活性（U/mg prot）=x×V 反总÷(V 样×Cpr)÷T×10³=2.1×x÷Cpr÷T

V 反总：反应体系总体积，0.105 mL=1.05×10^-4L；V 样：加入的样本体积，0.05 mL；T：反应时间，h；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；10³：单位换算系数，1 μmol =10³ nmol。

注意：对于样品中 Caspase-6酶活力特别高的情况，须用Working Cell Lysis Buffer适当稀释样品后再进行测定。计算时再乘以稀释的稀释倍数 n。